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X线照射对实验性癫痫大鼠脑皮层GABA和GABAA受体的影响

                 作者：陈家玉，梁树立，曾啸雄  

【摘要】  　　目的 探讨癫痫大鼠放射治疗中γ-氨基丁酸(GABA)及其受体的作用机制并选择合理放射剂量。方法 利用慢性点燃癫痫大鼠对照组、放射1组、放射3组进行0、24、6Gy的X线放射，对放射2组、放射4组和放射5组行12Gy的X线放射，每组10只，对照组和放射1组、放射3组于放射后1h断头取脑，放射4组于放射后1天、放射5组于放射后1周进行断头取脑，并观察放射5组其放射后癫痫发作情况，用氨基酸分析仪测定各组癫痫大鼠额叶皮层内的GABA含量变化，利用免疫组织化学方法观察抗GABAA受体阳性率。结果 放射5组于照射后1周内癫痫在鼠未出现诱发癫痫发作。放射1组的GABA含量为(254.16±44.68)ng，GABAA受体阳性率为(39.56±7.22)%，均明显高于对照组，12Gy照射后1h、24h、1周后均较对照组间GABA含量高，其中以24h最为明显，分别为(252.09±33.89)ng，(348.73±56.00)ng和(258.02±62.95)ng。抗GABAA受体阳性率在照射后1周内基本稳定于较高水平。学海网(www.xuehai.net)结论 放射治疗癫痫主要是通过发生快速而持续的GABA与GABAA受体变化发生作用，癫痫大鼠接受12Gy的放射治疗较为合理。

【关键词】  γ氨基丁酸 受体 GABA-A 癫痫 大鼠 X线

　　Abstract:  Objective  To investigate the role of GABA and GABAA  receptor play in radiotherapy of epileptic rat, and to look for the appropriate dose of radiotherapy for epilepsy.  Methods  A chronic pentylenetetrazole chemical kindling rat model of epilepsy was reproduced, and the rats were divided for control group and radio groups 1 to 5 with 10 rats in each group. Control group, groups 1 and 3 were given 0, 24, or 6Gy X ray irradiation to the brain in turns, and groups 2, 4 and 5 were given 12Gy X ray irradiation, the rats in control group, groups 1, 2, and 3 were killed 1 hour, and group 4 was killed on day 1, and group 5 was killed in 1 week after radiotherapy. Content of GABA was measured by amino acid analyzer, and GABAA receptor changes were assessed by immunohistochemical staining in frontal lobe of the brain of rats in all groups. Seizure of rat in group 5 were recorded in 1 hour, 24 hours or 1 week after irradiation.  Results  The epileptic rats in group 5 didn''''t suffer from seizure after radiotherapy. In group 1, the quantity of GABA was (254.16±44.68)ng，and positive rate of GABAA receptor was (39.56±7.22)%, which were higher than those in control group, the content of GABA in rats received 12Gy X-ray radiotherapy were (252.09±33.89)ng, (348.73±56.00)ng and (258.02±62.95)ng in 1hour, 1day and 1 week after irradiation, and significant higher than that in control group, also, the positive rate of GABAA R in those rats were significant higher than that in control group.  Conclusions  The efficacy of radiotherapy for epileptic rat might be attributable to rapid and sustained change in GABA and GABAA  receptors, and 12Gy appeared to be the appropriate irradiation dose for epileptic rat.
   
　　Key words:  GABA;  receptor,GABA-A; epilepsy; rats; X-rays   

　　临床发现放射治疗对癫痫发作可能有抑制作用，但其作用机制尚不明确。在癫痫的发作与治疗机制中γ氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)占有主导地位，本研究旨在通过观察X线照射对大鼠皮层内GABA和GABA A型受体(GABA A type receptor，GABAAR)α1亚单位含量的影响，探讨放射治疗癫痫的有效性及其可能的作用途径。

　　1  资料与方法

　　1.1  实验动物与分组 

　　清洁级SD (Sprague Dawley)大鼠60只（本院实验动物中心提供），6～7周龄，体重(200±10)g。第一次实验40只，随机分为对照组、放射1组、放射2组、放射3组，第二次实验在前次实验基础上选择合理的放射剂量对其余20只大鼠进行放射，随机分为放射4组、放射5组。

　　1.2 仪器与试剂 

　　戊四氮（pentetrazole, PTZ）、兔抗GABAAR α1亚单位抗体（G4416）购自美国Sigma公司、液体DAB酶显色试剂盒和酶标抗兔多聚复合物购自福建迈清公司，混合氨基酸标准液购自日本味之素公司、日立#2622-SC树脂氨基酸分析柱、日立L-8500氨基酸分析仪。

　　1.3 癫痫模型建立［1］ 

　　所有大鼠均每日上午9：00～10：00时给予PTZ 35mg/kg腹腔注射，连续1个月，注射后观察20min，癫痫发作分级标准参照Racine的方法。放射前所有大鼠及放射4、5组取样前1h均进行腹腔注射PTZ，放射5组在放射治疗后第4天再进行腹腔注射PTZ 1次。

　　1.4 放射治疗 

　　用氯胺酮与速眠新（2∶1）混合液腹腔注射（0.8mg/kg）对所有大鼠进行麻醉，麻醉后1h内利用垂直X线对大鼠头部进行放射，放射1组剂量为24Gy，放射2、4、5组均为12Gy，放射3组剂量为6Gy，对照组剂量为0Gy。

　　1.5 组织标本采集［2］ 

　　1～3组照射后1h内进行断头取脑，放射4组照射后24h进行取脑，放射5组照射后1周进行断头取脑，取出大脑后用滤纸吸去血液，脑组织置于胶片包裹的冰面上。

　　1.6 组织匀浆和GABA含量分析 

　　取下左侧额叶组织150mg放入匀浆管中并加入1.5ml磺基水杨酸，匀浆管置于0℃水中利用超声匀浆器破碎，在4℃低温高速离心机（1 5000r/min）离心15min，取上清液0.5ml，置于-81℃低温冰箱保存，1周内完成氨基酸含量分析。将样品融化后，用针头式滤器（0.45μl）过滤样品，在日立氨基酸分析仪上进行GABA测定，进样量为10μl，缓冲液流速0.4ml/min。

　　1.7 病理切片和免疫组织化学分析 

　　取0.5cm×0.5cm大小右侧额叶组织，石腊包埋4μm胶片(APES+丙酮)切片，常规脱蜡至水，0.3%过氧化氢溶液封闭处理10min，PBS溶液冲洗3次，微波抗原热修复10min，PBS液冲洗3次。然后分别加入一抗抗GABAAR α1亚单位抗体（1∶200稀释），室温1h 孵育，PBS液冲洗3次，然后加入二抗酶标抗兔多聚复合物30min，PBS液冲3次，DAB加过氧化氢混合液显色，5min后水冲洗，苏木素复染细胞核，酒精梯度脱水，二甲苯透明后中型树胶封片，镜检分析。阳性细胞率为在10个高倍镜（10×40倍）时同一视野内阳性细胞数/同类细胞总数。

　　1.8 统计学分析 

　　用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，测定数据用（±s）表示，样本间按成组资料进行方差分析（F检验），然后进行Q检验组间比较。

　　2 结果

　　2.1 癫痫模型的建立及生存情况 

　　大鼠出现Racine 3级以上发作在开始注射后的7～25天开始，至1个月时所有大鼠均在停药3天后重新注射PTZ可以出现3级以上发作，主要表现为双上肢阵挛、坐起、全身抽搐、跳起阵挛等症状。放射4、5组X线治疗大鼠在麻醉后3h恢复正常活动与饮食，无死亡，观察过程中未记录到癫痫发作情况。

　　2.2 不同剂量X线放射后GABA含量的测定 

　　对氨基酸分析试测定放射1、2、3组与对照组间的GABA含量变化情况见表1。其中放射1、2组较对照组GABA含量高差异均有显著性。表1  不同放射剂量GABA含量及抗GABAARα1亚单位阳性率(略)

　　2.3 放射后不同时间内的氨基酸含量变化 

　　氨基酸分析试测定12Gy放射后1h、1天、1周后与对照组间的氨基酸含量变化。其中放射各组均较对照组GABA含量高、抗GABAARα1亚单位阳性率高，且差异均有显著性，以放射后1天（4组）最为明显。见表2。表2  放射后不同时间GABA含量及抗GABAARα1亚单位阳性率 (略)

　　2.4 免疫组织化学结果 

　　阳性细胞时GABAARα1亚单位存在于神经胶质细胞内，表现为核呈深棕色染色。阳性细胞率见表1，表2。

　　3 讨论
    　
　　对脑肿瘤、血管畸形等疾病引起的症状性癫痫的放射治疗后发现癫痫症状有不同程度的好转，从而提示放射治疗对癫痫发作可能有抑制作用。Regis［3］用γ刀治疗16例颞叶癫痫的患者，随访1年中81%达到完全缓解，且除1例出现无症状性视野缺损外无明显并发症，但Srikijvilaikul［4］报道5例颞叶癫痫患者利用Regis同样的方法进行20Gy放射治疗，2例术后1年内死亡，另外3例均无效。所以放疗治疗癫痫的有效性及其可能的作用机制有待进一步研究。
    　　
　　GABA能神经元占大脑神经元的40%，当GABA含量下降超过40%时就可能出现癫痫发作。现有的抗痫药物也多是通过GABA产生作用，如苯二氮艹卓、苯巴比妥、丙戊酸是通过增加GABA的抑制，而新的抗痫药物的研究方面更加突出GABA的作用［5］，如氨己烯酸、加巴喷啶则、噻加宾等。GABA主要的作用是通过与突触部位的GABA受体结合而产生中枢兴奋的抑制作用，癫痫发作除了与GABA含量有关外还与GABA受体有关。GABA-R有多种类型［6～8］，其中主要包括A、B、C三种类型，Nishimura［6］等在电刺激癫痫持续状态和化学点燃的大鼠动物模型中都发现GABAAR的早期和持续的下降(43%～78%)，而B受体却有不同程度的升高，说明变化的最主要的是A受体。在A型受体中，又有很多的亚单位组成，Macdonald等［7］发现原发性强直—痉挛性癫痫与GABAAR的基因突变有关，而且不同亚单位的突变与不同的发作类型有明显的相关性。Ni等［8］发现在癫痫大鼠中不论是单次发作还是多次发作组中均有GABAAR α1亚单位的减少。本研究也选用了α1亚单位。
   
　　所以如果X线放射的方法使神经元中的GABA或者GABAARα1亚单位含量增加都可能产生抗痫作用。本研究显示癫痫大鼠在接受12～24Gy放射治疗后表现为GABA和GABAARα1亚单位含量的增加，而在6Gy的放射并不引起GABA的明显变化，说明在12～24Gy的X线放射都可能产生抗痫作用。长期效果的观察中发现GABA或者GABAARα1亚单位含量增加都可以在放射后24h达到高峰，并维持在较高水平达到1周以上，特别是GABAARα1亚单位在放射后1周内基本无明显的含量变化。而通过动物的癫痫发作情况也证实在治疗后癫痫未再见有自发或诱发的癫痫发作，与GABA和GABAARα1亚单位的增加结果相一致，说明这两个因素可能参与了X线照射后产生的抗痫作用，而且在早期就产生抗痫作用且维持时间较长。Ananeva等［9］认为低剂量照射后GABA的受体结构变化可能是影响突触电活动的主要因素。
    　　
　　放射治疗的剂量存在比较大的争议，尚不能确定多大的放射剂量对脑组织产生影响可以消除或减少癫痫的发作。Sun［10］在大鼠的海马癫痫模型上进行10、40Gy的放射治疗，发现40Gy组在放电频率和持续时间上都明显减少，而10Gy组效果不良。低剂量对脑组织无明显的细胞学的改变，而大剂量可以达到150Gy，此时则可引起明显的组织坏死和脑水肿，在癫痫治疗中应选择一个最低有效剂量，达到治疗的同时降低或避免脑组织损害。本研究中选择了6、12、24Gy三组剂量，发现后两组病例较对照组有明显的GABA和GABAARα1亚单位的增多，而两组间差异无显著性，且12Gy放射组中的这两者的增多也可能维持较长时间，所以12Gy应当是一个较为合理的癫痫治疗剂量，但对于大鼠治疗剂量与人类剂量间的关系尚待进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］Schandra AA, Mazarati AM, Godlevsky LS, et al. Chemical kinding: implications for antiepileptic drugs sensitive and resistant epilepsy models ［J］. Epilepsia,1996,37(3):269-274.

　　［2］王升旭,李求实.睡眠剥夺对大鼠脑组织氨基酸递质含量的影响［J］.第一军医大学学报,2002,22(10):888-890.

　　［3］Regis J, Bartolomei F, Rey M, et al. Gamma knife surgery in mesial temporal lobe epilepsy ［J］. J Neurosurg,2000,93(S3):141-146.

　　［4］Srikijvilaikul T, Najm I, Foldvary-Schaefer N, et al. Failure of gamma knife radiosurgery for mesial temporal lobe epilepsy: report of five cases ［J］. Neurosurgery,2004,54(6):1395-402.

　　［5］Czapinski P, Blaszczyk B, Czuczwar SJ. Mechanisms of action of antiepileptic drugs ［J］. Curr Top Med Chem,2005,5(1):3-14.

　　［6］Nishimura T, Schwarzer C, Gasser E, et al. Altered expression of GABA(a) and GABA(b) receptor subunit mRNAs in the hippocampus after kindling and electrically induced status epilepticus ［J］. Neuroscience,2005,134(2):691-704.

　　［7］Macdonald RL, Gallagher MJ, Feng HJ, et al. GABA(A) receptor epilepsy mutations ［J］. Biochem Pharmacol,2004,8(8):1497-506.

　　［8］Ni H, Jiang YW, Bo T, et al. C-Fos, N-methyl-d-aspartate receptor 2C, GABAA-alpha1 immonoreactivity, seizure latency and neuronal injury following single or recurrent neonatal seizures in hippocampus of Wistar rat ［J］. Neurosci Lett，2005,380(1-2):149-54.

　　［9］Ananeva TV, Dvoretskii AI. Pharmacological approaches to study of choline- and GABA-receptor sta tes in neuronal membranes after low doses irradiation ［J］. Radiats Biol Radioecol,2000,40(1):76-80.

　　［10］Sun-B, DeSalles-AA, Medin-PM, et al. Reduction of hippocampal-kindled seizure activity in rats by stereotactic radiosurgery ［J］. Exp-Neurol,1998,154(2):691-695.