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微囊化大鼠胰岛与睾丸Sertoli细胞联合移植实验研究

                   作者：周海丰 范玉宏 石小宁 周毅

【摘要】  目的：应用细胞微囊化方法、病理技术研究微囊化大鼠胰岛细胞与睾丸Sertoli细胞联合移植对糖尿病小鼠血糖的影响及Sertoli细胞对共移植的胰岛细胞的免疫豁免作用。方法:将30只小鼠随机分为2组，每组15只。第一组为胰岛细胞微囊化移植组,第二组为胰岛细胞与睾丸Sertoli细胞联合微囊化移植组,建立糖尿病模型后，两组均采用腹腔注射的方法将微囊植入糖尿病小鼠体内,术后两组均不使用免疫抑制剂,定期检测小鼠的血糖情况,比较两组之间胰岛细胞有功能存活时间的不同以及微囊的病理学改变。结果:胰岛细胞与睾丸Sertoli细胞联合微囊化移植组与胰岛细胞微囊化移植组相比,联合移植组胰岛细胞存活时间长于单纯移植组(P<0.05),囊周淋巴细胞侵润程度轻于单纯胰岛细胞移植组。结论：睾丸Sertoli细胞对共移植的胰岛细胞具有免疫豁免作用,可以延长胰岛细胞有功能存活时间,减轻排斥反应,降低囊周淋巴细胞侵润程度。学海网(www.xuehai.net)

【关键词】  大鼠;微囊化;Sertoli细胞;移植;胰岛;免疫豁免

　　【ABSTRACT】 Objective:To investigate the immune exemption for islet grafts induced by cotransplanted testicular Sertoli cells in rats and effect on blood glucose by co??microencapsulated rat islet cell and testicular sertoli cell through microcapsulation and pathyologic tecnology.Methods:Thirty mice were randomly divided into 2 groups with 15 in each one.Mice in the first group were transplanted microcapsulated islet and that in the second group were trasplated micro??capsulated islet and testicular sertoli cell.The microcapsules were all transplated into abdominal cavity of diabetic recipient for mice of two groups.Immunosuppressant was not applied and blood glucose was detected after operation so as to compare different survival time and pathologic alteration of microcapsule.Results:The survival time of islet in 2 groups was different.The time of cotransplantation was longer than that of simple cotransplantation(P<0.05)and infiltrated extent for lymphocyte of capsulated periphery in mice of group 2 was more gently than that in group 1.Conclusion:Testicular Sertoli cell can induce immune exemption for cotran??splanted islet;prolong the survival time of islet palliate rejection and degrade infiltration extent of lymphocyte of capsulated periphery.

　　【KEY WORDS】 Rats,Microencapsulation,Sertoli cell,Transplantation,Islets of langerhans

　　糖尿病是一组以慢性血糖(血葡萄糖)水平增高为特征的代谢疾病群,久病可引起多系统损害导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官的慢性进行性病变,引起功能缺陷和衰竭。目前临床上糖尿病的治疗方法(口服降糖药、皮下注射胰岛素、胰腺移植)大都是外源性补充胰岛素,不能长期而稳定的维持血糖在正常范围内,也不能降低并发症的发生率,本实验利用微囊包被技术,联合移植胰岛细胞和睾丸Sertoli细胞,与对照组(单纯移植微囊化胰岛细胞)作比较,探讨联合移植中Sertoli细胞对共移植的胰岛细胞的免疫豁免作用，以及Sertoli细胞在移植受体内减轻囊周受体淋巴细胞侵润的情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂 30只小鼠(BALB/C)(雌性)，每只平均体重为(20±5)g;Wistar雄性大鼠20只,(200±10)g;胰岛细胞，睾丸Sertoli细胞分离及培养试剂(CollagenaseV，Dnase I，Streptozocin，EDTA，HBSS 1×，Tris HCL，Exendin??4，所需试剂均由哈尔滨医科大学细胞移植实验室提供)，微囊发生器(自制)，二氧化碳孵箱(BB5060 Heraeus)。

　　1.2 实验方法 30只小鼠分2组，每组15只。实验组：应用CollagenaseV插管法分离得到的大鼠胰岛样细胞簇[1]和采用胶原酶Ⅴ、胰蛋白酶、DNaseⅠ二次消化法获得的Sertoli细胞[2]按照1∶(35～50)的比例联合包入微囊,将(2 000±100)个微囊移植入每只STZ诱导的糖尿病小鼠模型[3]腹腔内;对照组:大鼠胰岛样细胞簇单独制囊,将(2 000±100)个微囊移植入每只糖尿病小鼠模型腹腔内,两组术后均不使用免疫抑制剂。

　　1.3 监测指标

　　1.3.1 移植术后每天监测小鼠的血糖及病死率并记录 术后12h经断尾法测小鼠血糖浓度,以后每天测血糖浓度,非空腹血糖浓度≤11.1mmol/L持续 2d以上作为移植物有功能存活的标准,移植次日起第一周每天测血糖一次，以后每周3次,出现第一次血糖浓度≥11.1mmol/L的时间为排斥时间,连续两次≥11.1mmol/L作为移植物丧失功能的指标。

　　1.3.2 小鼠移植物(微囊)、内脏的病理学(HE染色)观察。

　　1.4 统计学分析

　　结果以(x±s)表示,组间比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 至实验结束，对照组及实验组各存活5只小鼠。胰岛细胞与睾丸Sertoli细胞共同培养3d后,胰岛贴附于Sertoli细胞生长,随着培养时间的延长,有大量的细胞从胰岛边缘增殖出来,导致原有的团状结构消失,在Sertoli细胞表面形成一层甚至数层细胞。联合培养组胰岛素的分泌量高于单独培养组,胰岛素的含量保持在较稳定的水平,下降缓慢。

　　2.2 微囊化胰岛及微囊化胰岛与Sertoli细胞联合移植后受体的血糖变化

　　移植后第一天内每隔12h经断尾法测小鼠血糖一次,结果表明刚植入的微囊并没有发挥调节血糖的作用,移植后第二天两组血糖均<11.1mmol/L(2组均未使用胰岛素)，对照组在7d后血糖值>11.1mmol/L;实验组在移植后第20天出现血糖升高，与对照组相比,Sertoli细胞促进了胰岛细胞分泌胰岛素及胰岛细胞的分化,对共移植的胰岛细胞产生了免疫豁免作用,延长了胰岛细胞有功能存活的时间(表1～2)。表1 二组培养液中胰岛素浓度的比较表2 移植物存活时间注：与对照组相比*P<0.05

　　2.3 微囊肉眼及病理观察

　　肉眼所见 将移植后血糖连续2次>11.1mmol/L的小鼠麻醉后剖腹,见移植处右下腹肠系膜血管周围、大网膜、肝门静脉周围聚集大量微囊，微囊被肠系膜血管、大网膜所包裹，脾门处未见微囊，微囊透明度下降，腹腔内未见到游离微囊。

　　病理结果 对照组见微囊周围重度淋巴细胞侵润、纤维化重(图1);实验组微囊周围轻度淋巴细胞侵润、纤维化轻(图2)。

　　3 讨论

　　糖尿病是目前危害人类健康的主要疾病之一，已成为发达国家继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病。就目前治疗方法而言,有皮下注射胰岛素、胰腺移植、胰岛细胞移植等。但是异种移植所引发的排斥反应常常导致移植失败，如何减轻受体免疫系统对移植物的排斥反应,使得移植物有功能长期存活并维持受体的正常血糖水平是目前急需解决的问题。免疫隔离技术(微囊化)的应用及不断发展减轻了受体对移植物的免疫攻击作用，同时又允许胰岛素、氧气和营养物质的自由进出，为胰岛细胞的存活提供了良好的空间,但是随着深入研究发现，组成微囊的材料以及制备微囊溶液的浓度和反应时间、微囊的孔径大小都会影响到微囊的通透性[4],并不能完全阻止受体小的免疫分子如补体及炎症因子的进入,继而诱发受体针对移植物的排斥反应。受体针对任何材料微囊化的同种或异种移植物所屏蔽的抗原的免疫反应始终存在，此种免疫反应会引起囊周纤维化[5] 使微囊通透性降低，阻碍了营养物质自由进出微囊,影响微囊化细胞的活性和功能,最终导致移植物丧失功能。如何减轻囊周纤维化，长期发挥微囊的调节血糖作用是目前异种胰岛移植所面临的主要问题。1865年意大利组织学家Sertoli发现的睾丸内有一种不规则大型拄状支持细胞。研究表明：此种细胞除了对生精细胞起支持和营养作用外,同时还高度表达FasL+(Fas Ligand,FasL)[6]，是Fas在体内的天然配体，Fas??FasL+[7]可以抑制激活的淋巴细胞增殖,通过激活Fas??FasL+诱导浸润的免疫细胞凋亡,从而防止免疫细胞破坏自身组织。由于侵润移植物的活化，淋巴细胞表达有大量Fas，Fas??FasL+系统诱导的受体淋巴细胞凋亡是局部免疫豁免的重要机制,从而可以延长移植物的存活时间。因此,将微囊化的胰岛细胞与FasL阳性的睾丸Sertoli细胞联合移植入糖尿病受体鼠体内可诱导受体的淋巴细胞凋亡，减轻囊周淋巴细胞侵润,为植入囊化胰岛细胞有功能长期存活奠定理论基础。

　　2000年Edomonton Protocol[8]的提出使得胰岛移植有了很大的进展,移植胰岛的存活时间明显延长,但是不管使用什么新型免疫抑制剂或者何种剂量,长期应用可出现许多不良反应如感染、肿瘤、粒细胞减少、致糖尿病等作用，并且对β细胞功能造成剂量依赖的破坏作用,甚至造成移植物丧失功能,导致移植失败。本实验通过Sertoli细胞和胰岛细联合移植结果表明胰岛细胞的存活时间明显长于对照组(单纯胰岛细胞移植组)。贾延??[9]等用实验证明,共同培养3d后,胰岛均贴附于Sertoli细胞生长,随着培养时间的延长,有大量的细胞从胰岛边缘增殖出来,联合培养过程中胰岛β细胞迅速扩增,而且培养20周后,尚能维持一定的胰岛数量和质量,胰岛素累积分泌量在共同培养组一直保持较高的分泌水平,培养3 周时达到峰值以后虽有一定程度的降低,但是仍高于培养1周的累积分泌量。Luca等[10]发现Sertoli细胞在体外对胰岛β细胞的增殖有显著的促进作用,同时可以使胰岛细胞由成熟状态逆转为幼稚状态,并使胰岛素的分泌水平显著高于对照组，这一结果于本实验的结果相吻合。

　　本实验病理结果表明，联合移植组囊周纤维化程度、淋巴细胞侵润程度均轻于单纯移植组,说明Sertoli细胞通过Fas??FasL+系统诱导了受体的淋巴细胞凋亡,对共移植的胰岛细胞提供了局部的免役豁免的微环境,延长了胰岛细胞有功能存活时间。此外,睾丸Sertoli细胞成为理想的移植协同者具有以下特征：①他们不再分化;②他们容易分离;③细胞能长期稳定的表达FasL+,无须进行基因转导等复杂且不稳定的操作;④植入的Sertoli细胞不会引起机体激素的变化，本实验利用支持细胞促进对共移植的胰岛细胞分化作用,二者联合微囊化植入糖尿病小鼠受体内,与对照组相比，维持小鼠的正常血糖水平的时间明显延长，此外Sertoli细胞通过Fas??FasL+系统诱导了受体的淋巴细胞凋亡，减轻受体淋巴细胞对微囊的侵润,减轻了受体对移植物的免疫攻击，这也是胰岛细胞长期发挥功能的重要原因，为胰岛细胞与Sertoli 细胞联合移植治疗糖尿病奠定了理论与实践基础。

【参考文献】
  　1 梁泉,董丽艳,薛承锐.大鼠胰岛细胞的分离、纯化和培养研究[J].中国老年保健医学,2009,7(2):62??63.

　　2 于利.大鼠睾丸的Sertoli细胞的分离纯化及体外培养[J].辽宁医学院学报,2008,29(3):204??205.

　　3 金勇,朱勇,吴南翔.实验性链脲佐菌素诱导的大、小鼠糖尿病动物模型研究进展[J].中国比较医学杂志,2009,19(3):80??82.

　　4 李保国,华泽钊,张洪德,等.胰岛素移植用免疫隔离微胶囊的牢固度、生物相容性和通透性研究[J].中国免疫学杂志,2001,17(2):85??88.

　　5 Reach G.Bioartificial pancreas[J].J Diabetes Med,1993,10(2):105??109.

　　6 张小爱,张旭辉,王常勇,等.大鼠FasL阳性Sertoli细胞的分离与鉴定[J].解放军医学杂志,2005,30(5):405??407.

　　7 胡中波.Fas在人体的表达及其意义[J].国外医学免疫学分册,2000,23(1):8??11.

　　8 卫国红,蔡德鸿,翁建平.埃德蒙顿方案后的同种异体人胰岛移植进展[J].中华糖尿病杂志,2005,13(6):475??477.

　　9 贾延??,杨于嘉,刘玲,等.胰岛与Sertoli细胞体外共同培养[J].中华内分泌代谢杂志，2002,18(2):148??151.

　　10Luca G,Calvitti M,Neri LM,et al.Sertoli cell??induced reversal of adult rat pancreatic islet beta cells into fetal??like status：potential implicationsfor islet transplantation in type Ⅰdiabetes mellitus[J].J Invest Med,2000,48:441??448.