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涿鹿柳蒿中氨基酸含量的测定

                      作者：田嘉铭 张进顺 张进顺

【摘要】  目的：建立柳蒿中氨基酸含量测定的高效液相色谱方法，并测定柳蒿中氨基酸的含量。方法：Hypersil AAA??ODS色谱柱(2.1mm×150mm 5μm)，采用梯度洗脱，检测波长330nm，柱温40℃。结果：线性范围：12.5～50pmoL?μL-1，平均回收率：96.2%～104.6%。结论：该方法快捷、稳定、重复性好，可用于柳蒿中氨基酸的含量测定。

【关键词】  柳蒿;氨基酸;高效液相色谱法

　　【ABSTRACT】 Objective：To investigate HPLC method in measuring Amino Acid in Artemisia selengensis Turcz.,and determine amino acid in Artemisia selengensis Turcz..Methods：Eclipse AAA column(4.6mm×150mm,5μm),using gradient solution and with detection wavelength at 330 nm,the temperature of column was 40℃.Results：The method was liner within the range of 12.5～50pmoL?μL-1,The average recovery of assay was 96.2%～104.6%.Conclusion：This method is fast,reliable and accurate.It can be used for determining Amino Acid in Artemisia selengensis Turcz..

　　【KEY WORDS】 Artemisia selengensis Turcz.,Amino acid,HPLC

　　柳蒿(Artemisia selengensis Turcz.)学名狭叶艾，菊科蒿属，多年生植物，以全草入药，秋季采，多鲜用，主治破血行瘀，上下通络，用于产后淤血停积，小腹胀痛，跌打损伤，淤血肿痛，因伤大小便下血。学海网(www.xuehai.net)本草纲目草部第十五卷记载：蒌蒿气味甘甜无毒，主治五胀邪气，风寒湿脾，补中益气，长毛发，久食轻身，耳聪目明，防衰[1]。柳蒿的营养价值很高，含有多种氨基酸和维生素，矿物质含量也很丰富，柳蒿含蛋白质14.8%，粗脂肪4.0%，粗纤维21.7%，无氮浸出物38.2%，灰分11.7%，钙1.09%，磷1.05%[2]。柳蒿不仅营养丰富，而且具有食疗和药疗的保健作用，民间还常用于治疗急性传染性肝炎。本实验拟建立柳蒿中氨基酸含量的柱前衍生HPLC测定法，并测定柳蒿中氨基酸含量。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　1.1.1 仪器 HP1100高效液相色谱仪(Agilent公司)，分析天平(1/100 000，日本)。

　　1.1.2 试剂 氨基酸标准品(含17种氨基酸)购于Agilent公司;甲醇、乙腈均为色谱纯(Agilent公司)，柳蒿来源于河北涿鹿赵家蓬区，野生，经本院中医系马淑兰教授鉴定。

　　1.2 方法

　　1.2.1 色谱条件

　　A液：称取2.720 0g含有三个结晶水的乙酸钠，放入1 500mL的烧杯中加入1 000mL三蒸水，使其完全溶解，然后加入180μL三乙胺，用1%～2%的醋酸调pH=7.2±0.05，再加入3.0mL四氢呋喃，混匀，过0.45μm滤膜。

　　B液：称取2.720 0g含有三个结晶水的乙酸钠，放入1 500mL的烧杯中，加200mL的三蒸水，使其完全溶解，用1%～2%的醋酸调pH=7.2±0.05，再加入400mL甲醇和400mL乙腈，混匀，过0.45μm滤膜。

　　OPA衍生法:待检样本200μL，加入200μL OPA，混匀，过0.45μm滤膜，在5min内进样20μL。色谱柱：Hypersil AAA??ODS色谱柱(2.1mm×150mm 5μm)，检测波长330nm，柱温40℃，梯度洗脱条件见表1。

　　1.2.2 标准曲线制作 精密吸取氨基酸标准品(100pmoL?μL-1)0.5mL，用0.1mol/L HCl作2，4，6，8，16倍稀释，每个稀释度按上述色谱条件进样20μL，结果以浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y),做标准曲线，得16种氨基酸回归方程，色谱图见图1。表1 梯度洗脱条件

　1.2.3 供试品溶液制备 精确称取已真空干燥的柳蒿细粉100.0g，置于500mL圆底烧瓶中，加入适量三蒸水，回流提取2h，滤出提取液，重复提取，合并两次提取液，减压浓缩定容至50mL，过0.45μm滤膜，按照1.2.1项下色谱条件中测氨基酸含量。

　　1.2.4 精密度实验 精密吸取标准品溶液20μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定其峰面积，计算RSD为1.40%～2.46%，说明本方法具有较好的精密度。

　　1.2.5 重复性试验 取1号样品5份，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，每份分别进样20μL，按上述色谱条件测定其峰面积，计算RSD为1.8%～2.6%，说明本方法有较好的重复性。

　　1.2.6 加样回收率实验 取已知各氨基酸含量的供试品溶液20μL，精密加入5，10，15，20，25μL氨基酸标准品，依照1.2.1项下色谱条件进样，计算平均回收率(n=5)分别为96.2%～104.6%。

　　2 结果

　　测得的氨基酸含量见表2，色谱图见图2。表2 柳蒿中氨基酸含量由于某些氨基酸在近紫外没有吸收，要达到在同一色谱条件下检测的目的，必须对样品进行衍生化处理，本文所采用的OPA柱前衍生法就是一种比较经典的氨基酸HPLC检测方法。但是因为OPA衍生时间对实验影响较大，所以要求进样时间应在5min之内完成。

　　柳蒿样品中胱氨酸(Cys)含量占其氨基酸总含量的26.14%。非必需氨基酸胱氨酸如果供给充裕可以节省必需氨基酸的需要量，胱氨酸和半胱氨酸可以相互转化，柳蒿中的高胱氨酸及其影响有待进一步研究。

　　柳蒿中含有丰富的氨基酸，尤其人体必需氨基酸的存在，为柳蒿药用价值的开发提供了有力的基础数据，柳蒿中氨基酸作为其药理有效成分有待进一步研究。该方法的灵敏度高，是测定柳蒿中氨基酸含量的较理想的方法。

【参考文献】
  　1 [明]李时珍.本草纲目[M].校点本上册.北京:人民卫生出版社,1982.946??948.

　　2 欧阳崇学.藜蒿中营养成分分析[J].中国畜产与食品,1998,1(5):13??14.