吴茱萸提取物的抗氧化作用
作者：甄攀 史国茹 张卫 乔海霞
【摘要】 目的：研究吴茱萸提取物清除羟自由基(?OH)和超氧阴离子自由基(?O-2)的作用。方法：用硫酸亚铁和过氧化氢反应产生?OH;用邻苯三酚自氧化法产生?O-2。用分光光度法测定吴茱萸正丁醇提取物1、正丁醇提取物2和乙醚提取物对?OH和?O-2 的清除作用。结果：三种提取物及Vc清除?OH的IC50分别为145.0、141.0、335.0、2.3μg?mL-1;正丁醇提取物1清除?O-2 的作用无法测定，吴茱萸正丁醇提取物2、乙醚提取物及Vc清除?O-2 的IC50分别为270.0、0.185、0.057 5μg?mL-1。结论：本研究中的三种吴茱萸提取物均有一定的抗氧化作用并呈量效关系。学海网(www.xuehai.net)吴茱萸脂溶性成分清除?O-2 的作用非常显著，与Vc有相似作用。
【关键词】 吴茱萸;抗氧化;羟自由基;超氧阴离子自由基
【ABSTRACT】 Objective:To study the removal function of exfract from Evodia rutaecarpa(Juss.)on hydroxyl radical(?OH )and Superoxide anion radical(?O-2).Methods:Kreaction of ferrous sulfate and hydrogen peroxide was used to generate?OH，with the pyrogallol autoxidation method producing ?O-2.The removing ability of n??butanol extract??1，n??butanol extract??2 and ether extract was determined by spectrophotometry.Results:IC50 of scavenging ?OH for these three kinds of extracts and VC were 145.0，141.0，335.0，2.3μg?mL-1 respectively;but the ability of removing ?O-2 of n??butanol extract??1 could not be determined，IC50 of the rest three were 270.0，0.185 and 0.057 5μg?mL-1 respectively.Conclusion:Three extracts from Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth. have some anti??oxidation，and showed dose??effect relationship.The ability of removing ?O-2 for liposolubles was very remarkable,and it had similar ability with that of Vc.
【KEY WORDS】 Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.,Antioxidation,Hydroxyl radicals,Superoxide anion radical
自由基是含有一个单电子的分子、离子或原子团，许多疾病的损伤机制都与其有密切关系。其中由氧自由基引起的氧化作用是导致生物组织损伤和病变的重要原因[1]。研究发现，超氧阴离子自由基(?O-2)、羟自由基(?OH)等与生物体损伤、衰老、心脑血管疾病等紧密相关。许多学者认为某些中草药的疗效与其抗氧化作用密切相关。已发现的植物药抗氧化成分有黄酮类、皂苷类、多糖类、有机酸类和萜类等。这些物质通过清除人体内自由基，还原体内氧化性物质，从而达到保护机体的作用[2]。
吴茱萸[Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.]是芸香科植物吴茱萸的干燥近成熟果实，具有温胃止吐、温脾止泻、镇痛、升高体温等作用。吴茱萸中含有皂苷、挥发油、生物碱、多糖、氨基酸和黄酮等多种有效成分。我们用硫酸亚铁和过氧化氢反应产生?OH，用邻苯三酚自氧化法产生?O-2，用分光光度法测定吴茱萸提取物对?OH、?O-2的清除作用[3??4]。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
UV754N紫外可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司制造)。
吴茱萸药材购于张家口市药材市场，由河北北方学院中医学院赵恒成老师鉴定。
人参皂苷Re对照品由中国药品生物制品检定所提供。
芦丁对照品由天津一方科技公司提供。
所用试剂均为分析纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 供试品的制备
1.2.1.1 乙醚提取物
吴茱萸干燥、粉碎，精密称取适量，用乙醚浸泡，1h后倒出乙醚液，再倒入适量乙醚，于35℃水浴中回流提取1h，重复上述步骤4次。提取液合并，过滤，蒸馏至无乙醚味，残余物即为吴茱萸乙醚提取物。
1.2.1.2 正丁醇提取物
上述用乙醚脱脂后的吴茱萸残渣挥干乙醚，用70%乙醇浸泡12h，于86℃水浴回流提取2h，重复提取3次。提取液合并，过滤，减压浓缩得浸膏。浸膏用水饱和的正丁醇浸泡、萃取多次至正丁醇萃取液几乎无色，正丁醇液合并，抽滤，减压浓缩。在此提取阶段得到二种提取物：①正丁醇浓缩液从烧瓶中倒出，在放置过程中沉淀出的沉淀物，用乙醚反复脱脂后，抽滤，得正丁醇提取物1;②从烧瓶中倒出的正丁醇浓缩液滤除沉淀后的上清液中加入大量乙醚，所得沉淀物用乙醚反复脱脂后，抽滤，得正丁醇提取物2。此二种提取物均在烘箱中于80℃烘干至无正丁醇味。
1.2.2 供试品的抗氧化
1.2.2.1 清除?OH的作用
体系中加入100mmol?L-1磷酸盐缓冲液(pH=7.4)3.0mL，5.5mmol?L-1FeSO41.0mL，6.5 mmol?L-1EDTA??2Na 1.0mL，0.6%H2O21.0mL，10mmol?L-1水杨酸钠1.0mL和不同体积正丁醇提取物1、正丁醇提取物2、乙醚提取物，用水定容为10mL。37℃恒温1h后，置于冰水中促灭。用UV754N紫外分光光度计于510nm测定不加样管的吸光度A标和加样管的吸光度A样。按下式计算?OH清除率：
学海网(www.xuehai.net)羟自由基清除率%=A标-A样A标×100%
1.2.2.2 清除?O-2的作用
体系中加入4.5mL Tris??HCl 缓冲溶液(pH=8.2)，1.0mL 1.0 mmol?L-1邻苯三酚(由10mmol?L-1HCl溶液配制)，一定体积的正丁醇提取物1、正丁醇提取物2、乙醚提取物，用水定容为9.0mL。用UV754N紫外分光光度计于325nm测定5min内不加样管和加样管的吸光度随时间的变化率B标和B样，按下式计算?O-2清除率：
超氧阴离子自由基清除率(%)=B标-B样B标×100%
2 结果
2.1 吴茱萸提取物清除?OH
吴茱萸正丁醇提取物1、正丁醇提取物2、乙醚提取物和维生素C清除?OH的作用见表1。表1 吴茱萸提取物清除?OH的作用
2.2 吴茱萸提取物清除?O-2
由于吴茱萸正丁醇提取物1在325nm处吸光度很大，无法测定其对?O-2清除作用。正丁醇提取物2、乙醚提取物和维生素C清除?O-2的作用见表2。表2 吴茱萸提取物清除?O-2的作用结果
3 讨论
前期研究发现，吴茱萸正丁醇提取物部分具有较强的抑菌作用[5]，也具有一定的清除亚硝酸盐的作用，本文试验结果提示吴茱萸正丁醇提取物还具有清除氧自由基的作用并呈量效关系。由此可见，正丁醇提取物应是吴茱萸的有效部位群之一。吴茱萸正丁醇提取物中主要成分有可能是皂苷和黄酮，因为皂苷类和黄酮类成分在水饱和的正丁醇中有较大的溶解度，因此，常用正丁醇提取总皂苷和总黄酮。含量测定结果(正丁醇提取物1中含有总皂苷28.71%、总黄酮43.25%，正丁醇提取物2中含有总皂苷31.27%、总黄酮44.31%)[6]也说明其中这两类物质含量较高。揭示吴茱萸总皂苷和总黄酮可能是其主要有效成分，对此有待进一步研究。
正丁醇提取物1在?O-2测定波长处吸光度很大，超出了仪器使用范围，无法测量。正丁醇提取物2则能顺利完成测量，说明二者含有不同的成分。正丁醇提取物1和2的抑菌作用、清除氧自由基的作用相似，总皂苷和总黄酮的含量相近，但清除亚硝酸盐的作用稍有差别。
乙醚提取物为脂溶性成分，其抑菌作用较正丁醇提取物作用弱，但其清除NO2-、?OH和?O-2的作用很强并呈量效关系，与维生素C有相似作用。说明吴茱萸脂溶性成分具有很强的抗氧化作用，是其抗氧化的主要有效部位，具有潜在的开发价值。
【参考文献】
1 陈主初.病理生理学[M].北京：人民卫生出版社,2001.83??95.
2 先红，吴可，孙存普.中药抗氧化活性的主要成分及其自由基清除作用[J].国外医学:中医中药分册，2003，25(3)：150.
3 甄攀，王治宝，张万明，等.吴茱萸多糖的提取及其氧化作用研究[J].中成药，2005，27(4)：491.
4 蔡仲军，陈仕江，尹定华，等.不同产地冬虫夏草清除羟自由基作用的研究[J].中药学，2004，35(1)：57.
5 乔海霞，甄攀，李秀娟，等.吴茱萸提取物体外抗菌作用的初步研究[J].河北北方学院学报:医学版,2009，26(1)：27.
6 张颖，甄攀，马媛媛，等.吴茱萸中总皂苷、总黄酮和总酚酸的含量测定[J].河北北方学院学报:自然科学版,2008，24(3)：27.
