加减三甲散及其拆方对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响
【摘要】 目的 通过观察加减三甲散及其拆方对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响，部分阐明本方及拆方治疗肝纤维化的机理。 方法 使用四氯化碳诱导复制大鼠肝纤维化模型，观察各组对大鼠肝细胞凋亡的影响。结果 各治疗组均能显著降低凋亡细胞数，与模型组比较，差异有非常统计学意义（P＜0.01）。结论 加减三甲散及其拆方能够通过降低细胞凋亡对实验性肝纤维化起到一定的治疗作用。
【关键词】 加减三甲散 滋阴 肝纤维化 肝细胞 凋亡
【Abstract】 Objective: To partly clarify the mechanism of Modified San Jia Powder and its Sub-Formulas on hepatic fibrosis by observing the Effects of them on hepatic cell Apoptosis of rats with hepatic fibrosis. Methods: Using CCl4 to copy the hepatic fibrosis model in rats, and hepatic cell Apoptosis is tested. Results: All the therapeutic groups can decrease the level of Apoptosis（P＜0.01）。 Conclusion: Modified San Jia Powder and its Sub-Formulas have the effects on experimental hepatic fibrosis by lowering the level of Apoptosis.
【Key words】 Modified San Jia Powder Yin-enriching hepatic fibrosis hepatic cell Apoptosis
肝纤维化是各种慢性肝病发展过程中的共同病理表现，是慢性肝病向肝硬化发展中的主要中间环节[1]。“客邪交固于血脉，主客交浑，最难得解，久而愈固，治法当乘其大肉未消、真元未败，急用三甲散，多有得生者”。三甲散乃吴又可创制，加减三甲散为本课题组在三甲散的基础上加以调整，为临床上治疗肝病的经验方。本实验在“主客交”理论指导下，通过观察加减三甲散及其拆方对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响，探讨该方治疗肝纤维化的机理。
1 实验材料
1.1实验动物
雄性SD大鼠 体重180～200g，由成都中医药大学实验动物中心提供。
1.2 实验药品
(1)加减三甲散及其拆方组水煎液(全方组药物:龟板15g、穿山甲10g、僵蚕10g、蝉蜕5g、鳖甲15g、土鳖虫10g、桃仁10g、当归10g、柴胡10g、白芍10g、甘草5g；滋阴组药物：鳖甲15g、龟板15g、当归10g、白芍10g、甘草5g；去滋阴药组药物：穿山甲10g、僵蚕10g、蝉蜕5g、土鳖虫10g、桃仁10g、柴胡10g) 购自北京同仁堂成都分店。以上药物经加水浸泡、常规煎煮、过滤及水浴蒸发制成每毫升含1g生药的水煎液（浓度100％），高温灭菌后4℃冰箱保存备用。
（2）秋水仙碱片：云南植物药业有限公司生产，0.5mg/片，批号：20080701，0.5mg溶于10ml蒸馏水配成悬浊液，4℃冰箱保存备用。
1.3 实验试剂
（1）四氯化碳分析纯专用试剂 纯度≥99.5% 质量标准GB/T688-1992 密度1.592～1.598(20℃)四川航嘉生物医药科技有限责任公司 批号：20080128，常温保存备用。
（2）鲁花花生油 山东鲁花集团有限公司，批号：3700116036。
（3）TUNEL凋亡检测试剂盒：美国ROCH公司产品。
1.4实验仪器
显微镜（LEICA DM 4000B）。
2 实验方法
110只大鼠随机分为正常对照组、病理模型组、阳性对照组、加减三甲散组、滋阴组、去滋阴药组，除正常对照组为10只外，其余各组各20只。除正常组外，其余各组均用四氯化碳腹腔注射造模，0.2ml/100g，首次0.5ml/100g，2次/周，共8周。加减三甲散组、滋阴组、去滋阴药组造模同时给予药物治疗，每天上午8点灌胃，连续8周。给药剂量按有关成人日用量与大鼠的体重体表面积比折算为等效剂量分别灌胃给予相应药物，阳性对照组予秋水仙碱水溶液0.5×10-3g/kg，加减三甲散组给予加减三甲散浸膏11g生药/kg，滋阴组给予滋阴药物浸膏5.5g生药/kg，去滋阴药组给予去滋阴药物5.5g生药/kg。正常对照组和病理模型组给予等容积生理盐水。共给药8周。实验结束时，除空白对照组外，其余各组随机挑选10只大鼠放血处死后,取肝脏组织用中性甲醛固定,石蜡包埋、切片,采用末端转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)法检测肝细胞凋亡,具体步骤按试剂盒要求进行。以细胞核呈棕黄色着色为阳性染色细胞，胞核无棕黄色着色为阴性细胞。每张切片随机取5个视野（高倍镜下）记数，取平均值为该片凋亡细胞数。实验结果采用SPSS11.5软件包进行统计学处理。
3 实验结果
模型组大鼠凋亡细胞数高于空白对照组，差异有非常统计学意义（P＜0.01），各治疗组均能显著降低凋亡细胞数，与模型组比较，差异有非常统计学意义（P＜0.01）。加减三甲散拆方组（滋阴组与去滋阴药组）与加减三甲散组比较，差异仍然有显著统计学意义（P＜0.01）。
4 讨论
细胞凋亡(Apoptosis)即程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，为非溶酶体核酸内切酶把细胞DNA切割成寡核苷酸体片断，继而使细胞裂解为凋亡小体。肝细胞凋亡是慢性肝病的一种重要病理改变, 与肝纤维化密切相关[2]。Takehara等发现抗凋亡因子Bcl—XL敲除小鼠在肝细胞持续凋亡6个月后可形成肝纤维化，并且认为肝细胞凋亡能够导致纤维化[3]。本实验各治疗组均能显著降低凋亡细胞数，说明加减三甲散及其拆方能够通过降低细胞凋亡对实验性肝纤维化起到一定的治疗作用。
肝纤维化现代病理认为，在病毒等多种因素作用下，肝炎病毒等整合于宿主肝细胞、免疫复合物形成、诱导自身免疫反应等，激发HSC，诱发纤维化病变，并伴随微循环障碍和血流动力学异常。而“主客交”病理状态则认为久病阴精耗伤，邪气滞留，络脉瘀阻。加减三甲散全方透邪通络、滋阴养血，正邪兼顾，其中穿山甲、龟板、僵蚕、蝉蜕、土鳖虫为异类灵动之品，善通络，直入厥阴肝络，搜邪化瘀通络；桃仁、当归辛润通络；鳖甲、龟板、当归、白芍、甘草滋阴养血；柴胡疏肝行气确为治疗肝纤维化的有效方剂。
课题来源：四川省科技计划项目(课题编号：2008JY0084)
参 考 文 献
[1] 程明亮，杨长青，刘三都等.肝纤维化的基础研究及临床[M].北京：人民卫生出版社，1996，17，183～186.
[2] 周滔，刘成海.肝细胞凋亡在肝纤维化中的作用[J].肝脏，2007，l2(6):503-505.
[3] Takehara T，Tatsumi T，Suzuki T，et a1．Hepatocyte-specific disruption of Bcl—XL leads to continuous hepatocyte apoptosis and liver fibrotic responses．Gastroenterology，2004，127：1189—1197．
