天然牛黄对自发性高血压大鼠脑细胞外液能量代谢及海马组织SOD活性与MDA含量的影响
天然牛黄对自发性高血压大鼠脑细胞外液能量代谢及海马组织SOD活性与MDA含量的影响
【摘要】 目的研究天然牛黄对于自发高血压大鼠（SHR）脑细胞外液能量代谢及海马组织SOD活性、MDA含量的影响。方法采用微透析技术观察单次给予不同剂量的牛黄后，SHR脑细胞外液葡萄糖（GLU）、乳酸(Lac)、乳酸/葡萄糖( L/G )、乳酸/丙酮酸(L/P)的变化，并于药后8h取大鼠海马组织，测定SOD活性及MDA含量。结果牛黄能明显的增加SHR脑细胞外液GLU的含量，显著提高SHR海马组织中的SOD活性、降低MDA含量。结论牛黄可以明显改善SHR脑内能量代谢，保护脑组织，并具有抗脂质过氧化的作用。
【关键词】 能量代谢 微透析 自发高血压大鼠 脂质过氧化
Abstract:ObjectiveTo study the effect of natural ox gallstone on energy metabolism,activity of SOD and content of MDA in SHR brain.MethodsThe changes of glucose，lactic acid，L/G，L/P in SHR brain ECF were observed by advanced microdialysis technology after single administration of natural ox gallstone and the activity of SOD and content of MDA were measured in hippocampus at the 8h hour after administration.ResultsThe natural ox gallstone could increase the content of glucose significantly, improve the activity of SOD,reduce the content of MDA .ConclusionThe natural ox gallstone can improve energy metabolism ，inhibit lipid peroxidation obviously，play a role of protection on brain.
Key words:Enevgy metabolism; Microdiclysis; SHR; Lipid peroxidation
有研究表明高血压最终会通过一系列血流或血管壁的变化导致机体能量代谢失衡，而能量代谢的变化也能够及时、准确地反应高血压对脑组织的损伤程度。本研究旨在通过采用灌胃的方法观察一次性投以单味天然牛黄对SHR脑细胞外液能量代谢物质及海马组织SOD活性、MDA含量的影响。
1 材料与仪器
1.1 试剂
Glucose, Lactate, Pyruvate 3种试剂盒(Sweden, CMA公司)。复方氯化钠注射液（145 mmol/L NaCl， 4 mmol/L KCl，3 mmol/L CaCl2, pH 7.0），天津天安药业股份有限公司产品，批号200505111。SOD，MDA试剂盒购自南京建成生物研究所产品，批号SOD20060217，MDA2005081，蛋白20051107。
1.2 微透析装置CMA/110液体开关，CMA/12探针（膜长2 mm，外径0.5 mm，截流分子量20 000道尔顿）及探针套管，CMA/120清醒动物装置，CMA/102微量泵，CMA/170低温样品自动收集器及软件（以上均由瑞典CMA公司生产）。手术设备：立体定位仪，CMA/150动物温度控制器，牙科钻。CMA600微透析自动分析仪( Sweden, CMA公司)，分光光度仪，全自动冷冻离心机。
1.3 药品天然牛黄购自河北省安国药材市场。
1.4 动物SHR大鼠24只，雄性，16周龄，体重（268±32）g北京维通利华实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（京）2002-0003。饲养在层流柜中，标准饲料喂养，自由进食及饮水。
2 方法
2.1 实验动物分组及给药方法24只大鼠随机分为4组，每组6只。其中空白给予蒸馏水，牛黄分为0.02，0.04，0.08 g/kg 3个剂量组。所有药物均于实验前按1 ml/100 g体重配置成溶液，在灌流达到稳定并且作为基础值的样品采集完毕后立即灌胃给药1次。
2.2 海马定位术将大鼠用10%水合氯醛麻醉(3 ml·kg-1, ip ),剃毛，暴露头顶皮肤，立体定位仪固定，开皮，分离皮下组织，暴露头骨，确定前囱位置，以钻孔器在大鼠海马CA1区(坐标:AP 3 mm, ML 1.5 mm, DV 3.5 mm )上钻一直径为1.5 mm的小孔，并将CMA/12探针套管插入，牙托粉固定。手术过程中，用CMA/150动物温度控制器将大鼠体温控制在37℃。
2.3 微透析取样术后24 h，在动物清醒自由活动状态下，拔出套管内芯，插入CMA/12探针，将大鼠放入CMA/120动物清醒装置内。探针的进出口端分别连接2条聚乙烯管，进口管连接CMA/102微透析泵，出口管连接CMA/170低温收集器。CMA/102微透析泵的灌流速度为1.5 μl·min-1，灌流液为林格氏液。探针插入后灌流1h使其平衡，取得稳定的基础值。给药前收集1个样本，以此样本的检测值作为给药前基础值。样本收集时在4℃下进行，收集的样本立即放入-70℃低温冰箱内保存待测。
2.4 能量代谢产物的测定利用CMA600微透析自动分析生化仪和相应试剂盒对所收集的透析液进行成分含量测定。透析液中的GLU、Lac和Pyruvate分别在葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶的作用下和试剂反应，生成苯醌二酰亚胺(quinonediimine),根据苯醌二酰亚胺的含量可计算透析液中3种物质的相应浓度。
2.5 SOD活性及MDA含量的测定给药后8 h将SHR断头处死，迅速剥离大鼠的海马组织，称重，加9倍体积的冰生理盐水，在冰浴下研磨，制成10%脑匀浆。3 000 r/min离心10 min，取上清液，按试剂盒操作测定SOD活性含量及MDA含量。
2.6 统计学处理用SPSS10.2软件包进行统计学处理，数据用±s表示，前后比较用配对t检验，组间比较用单因素方差分析。
3 结果
3.1 牛黄对于SHR脑细胞外液能量代谢的影响
3.1.1 牛黄对SHR海马细胞外液GLU的影响
对照组海马细胞外液GLU水平在6h内呈现了逐渐降低的趋势。与对照组相比，牛黄各组GLU含量均有不同程度的升高，但均未表现出统计学意义：其中牛黄0.04 g/kg组在给药后6 h内始终高于对照组；牛黄0.02，0.08 g/kg组则在给药后3～6 h均高于对照组水平，牛黄0.08 g/kg组起效相对较晚，但升高的幅度较大。结果见表1。表1 牛黄对SHR海马细胞外液GLU的影响（略）
3.1.2 牛黄对SHR海马细胞外液Lac含量的影响
对照组海马细胞外液Lac水平呈现了逐渐升高的趋势。牛黄各组则表现出不同程度的降低海马细胞外液Lac水平的作用，与对照组相比，牛黄0.02 g/kg组在给药后3～4 h开始出现显著性差异( P﹤0.01)，并且这种趋势逐渐加大；牛黄0.04 g/kg在给药后1～2 h开始出现统计学意义( P﹤0.05)；牛黄0.08 g/kg组在药后3～4 h左右开始出现统计学差异(P﹤0.01)，且该组下降幅度大于其它两组。结果见表2。表2 牛黄对SHR海马细胞外液Lac的影响（略）
3.1.3 牛黄对SHR海马细胞外液L/G的影响
对照组海马细胞外液L/G水平表现为持续增高的趋势。牛黄各组都显示出了明显的降低海马细胞外液L/G水平的作用。与对照组相比，在所观察的6h范围内，牛黄0.02 g/kg组始终维持较低水平,并在给药后3～4 h开始出现统计学差异（P﹤0.01）；牛黄0.04 g/kg组在给药后1～2 h即有明显降低,在给药后3～6 h出现了显著差异( P﹤0.01)；牛黄0.08 g/kg组L/G水平在给药后1～2 h开始持续明显降低,并在3～6 h出现了统计学差异（P﹤0.01）。牛黄0.08 g/kg组下降时间滞后，但3～6 h的下降幅度大于其它两组。结果见表3。表3 牛黄对SHR海马细胞外液L/G的影响（略）
3.1.4 牛黄对SHR海马细胞外液L/P 的影响
对照组海马细胞外液L/P水平在6h内并无明显变化。牛黄各组均表现出不同程度的降低海马细胞外液L/P水平的作用，与对照组相比，牛黄0.02 g/kg组在给药后1～2 h即有明显降低( P﹤0.05)，随后显著性逐渐加大(P﹤0.01)。牛黄0.04 g/kg组降低趋势明显，并在给药后5－6h开始出现统计学意义( P﹤0. 01)；牛黄0.08 g/kg组L/P水平降低的时相较晚，但趋势明显,在药后3～4 h即明显低于对照组水平( P﹤0.05),且这种趋势在逐渐加大。结果见表4。表4 牛黄对SHR海马细胞外液L/P的影响（略）
3.2 牛黄对SHR脑组织脂质过氧化的影响
3.2.1 牛黄对SHR脑组织SOD活性的影响结果见图1。牛黄各组均表现出明显的升高SHR脑组织SOD活性的作用，且不同剂量的牛黄效果不同。与对照组相比，0.04 g/kg牛黄的效果最好（P﹤0.01），0.02 g/kg牛黄和0.08 g/kg牛黄的效果次之，但也有明显差异（P﹤0.05）。见图1。
3.2.2 牛黄对SHR脑组织MDA含量的影响结果见图2。牛黄各组均显示出明显降低SHR脑组织MDA含量的作用，与对照组相比有显著差异(P﹤0.01)，其中0.04 g/kg效果最佳。见图2。
4 讨论
研究表明，高血压最终会通过一系列血流或血管壁的变化导致机体能量代谢失衡。脑的能量对维持细胞内外离子梯度、细胞膜完整性、神经元胞体和轴突之间的物质运输、细胞之间的信息传递、合成代谢、递质释放、摄取等至为重要。一旦脑血流供应中断、能量耗竭,立即引起脑功能丧失和脑组织的广泛损伤，因此，能量代谢的变化能够及时、准确的反应机体脑组织的损伤程度。
脑的能量供应几乎100%来自GLU氧化，它是中枢神经组织的唯一能量物质。GLU代谢障碍是缺血性脑损伤的主要原因之一［1］。在氧的充分供应下， 脑组织内GLU燃烧成CO2和水,然后放出能量,供脑代谢所需。脑缺血致GLU代谢异常有3个不同的时相,首先是脑缺血的发生，接着是能量耗竭,随后是恢复或终致神经细胞损伤、死亡。因此，脑内GLU代谢水平的变化直接反映了脑的功能情况。本研究结果表明，虽然与对照组相比，牛黄各组均未表现出统计学差异，但牛黄0.04g/kg组GLU的含量在给药后6 h内始终高于对照组；牛黄0.02，0.08g/kg组则在给药后3～6 h均高于对照组水平。提示牛黄确有改善SHR脑细胞外液能量代谢，增加能量储备的作用，且呈现一定的剂量相关性。
GLU在神经组织中先分解成Pyruvate，在有氧环境中，经三羧酸循环完成产能代谢过程，释放大量能量，在缺氧的情况下，则进入糖酵解代谢过程，形成Lac，释放的能量大大减少。因此, Lac和Pyruvate是葡萄糖代谢的中间产物，而 Lac及L/P的升高通常被认为是氧化代谢障碍的一种指标［2，3］。L/G比例升高与死亡率增高密切相关，Lac增加、GLU水平下降表明脑组织无氧酵解加速，无氧酵解的速度与预后有关。在脑损伤过程中，Lac和GLU含量呈相反的变化趋势，其比值常作为判断脑损伤严重程度的重要指标。本研究结果表明牛黄各组的Lac，L/P，L/G水平均较对照组下降明显，且Lac，L/G下降的水平体现了一定的剂量相关性，说明牛黄确能明显降低SHR脑细胞外液Lac水平，改善脑代谢，减轻脑损伤。牛黄0.08 g/kg组的各观察指标下降开始的时间均较其它两组明显滞后。
脑缺血时能量代谢障碍产生大量的自由基攻击生物膜中不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化。检测MDA含量和SOD活性常可以间接反映细胞损伤程度和机体清除氧自由基的能力。本研究发现，牛黄可明显提高SHR海马组织中的SOD活性，并显著降低SHR海马组织中的MDA含量，提示不同剂量的牛黄具有显著的抗脂质过氧化作用，其中0.04g/kg剂量组效果最好。
上述结果表明，牛黄不但可以通过增加脑细胞外液的GLU储备，降低Lac含量，改善能量代谢，发挥脑保护作用，而且可以升高海马组织中的SOD活性，降低MDA含量，发挥抗脂质过氧化作用。在抗脂质过氧化方面，牛黄0.04 g/kg组效果最好，在对能量代谢的影响效果方面，牛黄各组与剂量成正相关，但牛黄0.08 g/kg组起效较慢，其原因有待于进一步研究。
【参考文献】
［1］Zhang H，Zhang X，Zhang T，et al .Excitatory aminoacids in cerebrospinal fluid of patients with acute head injuries .Clin Che m，2001，47:1458..
［2］Chamba G, Renaud B. Distribution of tyosine hydroxylase ,dopamine beta-beta-hydroxylase and phenytel hanolamine-N-methy1 transferase activities in coronal sections of the rat lower brainstem. Brain Res ,1983 ,259(1):95.
［3］Eliash S, Shteter N, Eilam R. Neuroprotective effect of rasagiline, a monoamine oxidase-B inhibitor, on spontaneous cell degeneration in a rat model . Neural Transm. 2005, 112(8): 991.
