抑肝纤及拆方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1，PAI-1蛋白表达的影响
抑肝纤及拆方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1，PAI-1蛋白表达的影响
【摘要】 目的探讨抑肝纤及拆方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1，PAI-1蛋白表达的影响。方法采用四氯化碳（CCl4）法复制大鼠肝纤维化模型，应用免疫组化方法观察抑肝纤及拆方对肝纤维化模型大鼠肝组织TGF-β1，PAI-1表达的影响。结果各组动物治疗后，肝组织TGF-β1，PAI-1蛋白表达量均有不同程度的降低，其中抑肝纤全方组较其他用药组下降明显。结论中药复方抑肝纤及拆方可有效防治大鼠肝纤维化，尤以抑肝纤全方作用最佳，其作用机制可能是通过抑制肝纤维化组织TGF-β1，PAI-1蛋白的表达实现的。
【关键词】 肝纤维化 中医治法 TGF-β1 PAI-1 免疫组化
Abstract:Objective To investigate the influence of Yiganxian decoction and its separated decoction on the expression of TGF-β1 and PAI-1 protein in liver tissue of hepatic fibrosis in rats . MethodsLiver fibrosis model rats were induced by carbon tetrachloride, the expression and localization of TGF-β1 and PAI-1 in liver tissue were analysed by the method of immunohistochemistry. ResultsAfter treatment with medication, the positive expression of TGF-β1 and PAI-1 protein in liver tissue was decreased at different levels. Yiganxian decoction was better than other groups.ConclusionYiganxian decoction and its separated decoction can effectively prevent and treat the liver fibrosis in rat model. Yiganxian decoction is the most effective. Its mechanism may be related with inhibiting the expression of TGF-β1 and PAI-1 in liver fibrosis tissue.
Key words:Liver fibrosis; Herbal therapy; TGF-β1; PAI-1; Immunohistochemistry
肝纤维化是肝脏对各种因素所致的慢性损伤的一种修复反应，是大多数慢性肝病所共有的病理过程，也是各种慢性肝病向肝硬化过度的中间环节，其特征是细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在肝内过度沉积［1］。
中药复方抑肝纤是王继教授治疗肝病的经验方，我们在前期实验研究中业已证实抑肝纤对肝纤维化有一定抑制、逆转作用［2］。本实验按中医治疗原则进行拆方研究，观察抑肝纤全方及拆方对肝纤维大鼠肝组织TGF-β1，PAI-1蛋白表达的影响，旨在从更深层次上探讨抑肝纤方的抗肝纤维化作用机理及组方规律。
1 材料
1.1 动物
健康雄性Wistar大鼠48只，清洁级，体重（200±20） g，购自河北医科大学动物实验室。
1.2 用药
无菌40%四氯化碳（CCl4）花生油溶液，购自天津化工二厂。抑肝纤全方及拆方药物购于河北医科大学中医学院门诊部，由白求恩国际和平医院药剂科水煎，浓缩制备。抑肝纤全方由黄芪、 白术、丹参、川芎、鳖甲、牡蛎等7味中药组成，煎剂生药含量为3 g/ml，拆方组丹参、川芎煎剂生药含量为0.69 g/ml，黄芪、白术煎剂生药含量为1.38 g/ml, 鳖甲、牡蛎煎剂生药含量为0.7 g/ml。各治疗组大鼠生药用量均按相当于成人口服剂量的10倍计算。
1.3 试剂
转化生长因子β1（TGF-β1）免疫组织化学染色试剂盒：购于北京中山生物技术有限公司；兔抗大鼠血浆酶原激活酶抑制因子-1，羊抗兔IgG购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.4 方法
1.4.1 动物分组、模型复制及给药方法
48只大鼠在正式实验前适应性饲养一周后，随机分为6组，每组8只，即正常对照组、模型组、抑肝纤组、拆方组按中医治则进行拆方分为丹参、川芎组、黄芪、白术组和鳖甲、牡蛎组。除正常对照组外，其余5组参照Wang等方法［3］略加改进，进行模型复制，40%四氯化碳（CCl4）花生油溶液大腿内侧皮下注射，0.3 ml/100 g体重,2次/周，正常对照组注射等量生理盐水，持续8周。在造模8周后第2天起，各治疗组分别给予相应剂量（1 ml/100 g体重）的对应药物灌胃，1次/d。正常组与模型组按1 ml/100 g体重灌以蒸馏水，1次/d。共治疗8周。
1.4.2 标本制备
治疗8周末，于最后1次给药后禁食12 h,断头处死所有动物，迅速剖取肝脏，每次在肝左叶相同部位上取1 cm×1 cm×1 cm大小组织块，免疫组化标本固定于4%多聚甲醛和0.1%戊二醛混合固定液，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。其余的肝组织立即于-70℃冰冻保存。
1.4.3 检测指标
免疫组化SP法分别测定转化生长因子β1（TGF-β1），1-型纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）蛋白在大鼠肝组织内的定位表达，并用北京航空航天大学CMIAS病理图像分析系统检测阳性表达的面密度。 检测方法严格按照说明书操作。
1.5 统计学处理
计量资料的各变量均采用±s表示，应用SPSS11.5 统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）。组间两两比较用LSD法。
2 结果
2.1 肝组织TGF-β1 免疫组织化学染色及图像半定量分析TGF-β1在正常肝细胞中极少量表达；模型组大鼠肝组织TGF-β1表达明显增强，阳染细胞数目增多，呈棕黄色胞浆型分布；经治疗后，各治疗组阳染程度较模型组均明显减轻，阳染细胞数目明显减少，以抑肝纤全方组减轻最明显。免疫组化图像半定量分析结果见表1。表1 各组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达结果比较(略)
2.2 肝组织PAI-1免疫组织化学染色及图像半定量分析N组大鼠肝组织中PAI-1微弱表达；模型组大鼠肝组织PAI-1表达明显增强，阳染细胞数目增多，PAI-1阳性染色为棕黄色。经治疗后，抑肝纤组、丹参、川芎组、黄芪、白术组阳染程度较模型组明显减轻，以抑肝纤全方组减轻最明显。鳖甲、牡蛎组减轻不明显。免疫组化图像半定量分析结果见表2。表2 各组大鼠肝组织PAI-1蛋白表达结果比较(略)
3 讨论
中医整体观认为，人体是一个有机的整体，“肝病传脾”“肝肾同源”及“肝胆表里”等脏腑关系，决定了肝脏病的中医脏腑病机是以肝为中心、肝脾肾胆胃功能的失调。在治疗肝脏疾病时，不能单纯考虑肝之一脏，而应注意调整肝脏与其他脏腑的关系，多层次多角度地考虑治肝方法。
抑肝纤针对慢性乙型肝炎肝纤维化本虚标实，虚淤共存，肝脾不和，气滞血淤的病机，主要由益气活血、软坚散结等药物组成。方中黄芪、白术益气健脾，取“肝病实脾”之意；丹参为活血化淤良药，古云：“一味丹参饮，功胜四物汤”，其活血作用可解肝郁，使血能养肝，正针对肝血淤这一肝纤维化关键；川芎辛散温通，既能活血祛淤，又能行气开郁，为血中之气药。《纲目》谓川芎“肝苦急，以辛补之，故血虚者宜之，辛以散之，故气郁者宜之”；柴胡舒肝解郁，宣畅气血；鳖甲、牡蛎软坚散结。方中各药协同作用，用后使正气旺盛，血行通畅，积块自消。
肝星状细胞（HSC）是调控肝脏ECM沉积的最重要细胞，其激活是肝纤维化发生的中心环节。TGF-β1是HSC产生ECM的主要刺激物。TGF-β1不仅促成HSC转化为肌成纤维母细胞（MFB），而且能诱导ECM基因的表达上调，刺激ECM的合成，而刺激肝纤维化进程，如果阻断TGF-β1合成可显著降低肝纤维化［4］。研究还显示，TGF-β1可抑制谷氨酰半胱氨酸连接酶的表达，促进肝细胞损害，还能抑制肝细胞DNA合成，阻止肝细胞再生［5］。
PAI-1属丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，PAI-1通过结合尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）抑制其纤溶激活作用，导致纤溶酶和基质金属蛋白酶系统活性下调，ECM在肝内沉积明显增加。各种刺激因子使HSC 维持持续激活状态，不断分泌TGF-β1，可反馈性的引起PAI-1表达增加，已有研究表明［6，7］，通过抑制TGF-β1的信号传导，可以减少HSCⅠ型胶原的蓄积，同时下调PAI-1的表达。TGF-β1，PAI-1在肝纤维化发生发展过程中发挥重要作用，下调TGF-β，PAI-1表达，可能有助于抑制HSC的激活，促进ECM的降解，从而阻止或逆转肝纤维化进程。
本实验通过CCl4法复制大鼠肝纤维化模型，按中医不同治则进行拆方，观察抑肝纤全方及拆方对肝纤维大鼠肝组织TGF-β1，PAI-1蛋白表达的影响，研究发现，模型组大鼠TGF-β1，PAI-1蛋白表达明显升高，经治疗后，各药物组均有不同程度的下调，其中以抑肝纤全方组下调作用尤为明显，黄芪、白术组，鳖甲、牡蛎组能明显下调TGF-β1蛋白表达，丹参、川芎组下调PAI-1蛋白表达作用明显。表明中药复方抑肝纤及拆方组具有良好的抗肝纤维化作用，尤以抑肝纤全方效果最好，其作用机制可能是通过抑制肝纤维化组织TGF-β1，PAI-1蛋白的表达, 抑制HSC的活化，促进ECM降解，进而逆转肝纤维化的进程。从而证实TGF-β1，PAI-1是抗肝纤维化的一个治疗靶点，为延缓肝纤维化的进展提供了一个新思路。从一个侧面提示，与单纯从单一治则入手寻找有效方法的治疗学观点相比，中药复方的优势重在体现中医治疗思维方式指导下的综合整体作用。肝纤维化毕竟是一个极其复杂的综合病理过程，非一法、一药能解决问题，而应综合考虑，全面兼顾才能取得良效，单从一个角度切入是很难取得较好效果的。
在临床实践中，肝纤维化的治疗应针对个体特点、病因病机特点有所侧重，如淤血阻络证应注重活血化淤，脾虚不运者应注重益气健脾等，在此基础上再伍用其他治则。CCl4中毒性肝纤维化模型与肝炎病毒所致之肝纤维化组织病理变化相似，但在病因及发病机制上是不同的，在目前尚无用肝炎病毒复制肝纤维化模型的条件下，CCl4中毒性肝纤维化模型适用于肝纤维化的动物实验研究。根据肝纤维化发生发展的不同病机设立不同中药药物组观察研究，从而充分体现中医辨证论治的特点有待进一步进行。
【参考文献】
［1］Pressor CC,Yen RD,Wu J.Molecular therapy for hepatic injury and fibrosis: where are we［J］.World J Gastroenterol 2006,12：509.
［2］王继，李兵顺，甄彦君，等.“抑肝纤”对大鼠实验免疫损伤性肝纤维化阻断作用的研究［J］.中国中医基础医学杂志，1998，4(9)：19.
［3］Wang Y Q, Ikeda K, Ikebe T, et al. Inhibition of hepatic stellate cell proliferation and activation by the semisynthetic analogue of fumagillin TNP-470 in rats［J］.Hepatology, 2000, 32(5)：980.
［4］Shek FW, Benyon RC. How can transforming groth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis［J］.Eur J Gastroenterol Hepato, 2004, 16(2):123.
［5］余 姣，徐可树. TGF-β家族在肝纤维化中的不同作用及对策［J］.世界华人消化杂志，2006，14（28）：2789.
［6］Liu XJ, Ruan CM, Gong XF, Li XZ, Wang MW, Yin JQ.Antagonism of transforming groth factor beta signaling inhibits fibrosis-related genes［J］.Biotechnol Lett 2005,27:1609.
［7］Liu X,Wang W,Hu H,Tang N,Zhang C,Liang W, Wang M.Smad3 specific inhibitor,naringenin,decreases the expression of extracelluar matrix induced by TGF-β1 in cultured rat hepatic stellate cells［J］.Pharm Res 2006,23:82.
