景天三七中总黄酮提取条件和含量分析
【摘要】 目的：研究不同提取溶剂对景天三七中总黄酮的含量影响及最佳提取条件下总黄酮的含量。方法：采用盐酸?裁痉鄯ê痛姿崆Ψǘ跃疤烊?七中总黄酮进行检识，并用不同溶剂对景天三七中总黄酮进行了提取，以分光光度法测定总黄酮含量，以芦丁为标准品，以10%Al(NO3)3??5%NaNO2为显色剂，在508nm波长处进行测定。结果：检识试验证明景天三七中含有黄酮类物质，且最佳提取溶剂为80%乙醇(P<0.05)。在此提取条件下，测得景天三七中总黄酮的含量为18.39mg?g-1，RSD为2.2%(n=5)。总黄酮测定线性范围为15.20～45.60μg?mL-1(r=0.999 7)，平均回收率为95.74%，RSD为0.98%(n=6)。学海网(www.xuehai.net)结论：景天三七中黄酮类物质的最佳提取溶剂为80%乙醇。本法准确可靠，重现性好，结果稳定，适合于景天三七中总黄酮含量分析。
【关键词】 景天三七;黄酮;分光光度法
【ABSTRACT】 Objective：To study the extracting conditions and determination for total flavonoids in Se??dum Aizoon L. with different solvent. Methods：To determine the flavonoids in Sedum Aizoon L. by HCl ?? Mg and Pb(AC)2 reactions. Rutin was taken as standard，the colour??developing agent was the mixed solution of 10%Al(NO3)3～5%NaNO2.The total flavonoids in Sedum Aizoon L. were analyzed by spectrophotometry at 508nm,and series of extracting solvents were used to total flavonoids.Results：There were flavonoids in Sedum Aizoon L. and the best extracting solvent of all was 80% ethanol.Calibration curve was constructed in the range of 15.20～45.60μg?mL-1(r=0.999 7)for total flavonoids.The average recovery was 95.74% and RSD of the methods was 0.98%(n=6).The average content of total flavonoids was 18.39mg?g-1 with 80% ethanol extracting.Conclusion：The best extracting solvent of all for total flavonoids in Sedum Aizoon L.was 80% ethanol.The method was accurate，reliable，reproducible and stable for total flavonoids in Sedum Aizoon L.
【KEY WORDS】 Sedum Aizoon L.,Flavone,Spectrophotometry
景天三七(Sedum Aizoon L.)为景天科景天属植物，别名土三七、费菜、血散、养心草，性平，味甘，微酸，无毒，有凉血止血，散瘀，消炎，安神，镇痛等作用[1],景天三七的广泛用途越来越多地被人们所接受。研究表明，景天三七中含有没食子酸等多种酚酸以及谷甾醇、多糖等成分[2??5]，但有关景天三七中黄酮类成分的研究较少。而黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗癌、解热、保肝、抗衰老等作用[6]。我们通过对景天三七中总黄酮的提取条件和含量进行研究，对进一步研究景天三七的药用价值具有指导意义。
采用水及不同浓度的乙醇溶液为提取溶剂，利用分光光法测定总黄酮的含量，比较不同溶剂对景天三七中总黄酮提取效率的影响。
1 材料与方法
1.1 仪器
721分光光度仪(上海)，A/D分析天平(1/10万，日本)，万分之一天平(上海)，电热恒温水槽(上海)。
1.2 试药
野生景天三七(根)采自河北省张家口，由我校王德富老师鉴定。芦丁对照品购自中国生物制品检定所，其余试剂均为分析纯，试验用水为二次去离子水。
1.3 实验方法
1.3.1 景天三七中黄酮类化合物检识
取景天三七药材的干燥粉末42.7g在沸水浴中进行提取2h，对提取液中黄酮类物质进行检识。本试验按文献[7]采用两种方法检识。第一种方法为盐酸?裁痉鄯从Γ?向提取液中加少许镁粉，振摇，然后滴加几滴浓盐酸，几分钟后溶液中上升泡沫呈红色;第二种方法向提取液中加醋酸铅溶液，生成棕黄色沉淀。通过以上两种方法可知景天三七中含有黄酮类物质。
1.3.2 标准曲线绘制
1.3.2.1 芦丁标准溶液的配制 准确称取120℃干燥恒重的芦丁标准品15.20mg，用95%乙醇溶解，定容至50.00mL，摇匀，得浓度为0.304 0mg?mL-1的芦丁标准溶液。
1.3.2.2 吸收曲线的制作 取上述芦丁标准溶液1.20mL于10mL比色管中，加水至3.00mL，加入5%亚硝酸钠水溶液0.50mL，混匀，放置6min。加入10%硝酸铝0.50mL，摇匀，放置6min后加入4%氢氧化钠3.00mL，混匀，用蒸馏水定容至10.00mL，摇匀，放置15min。以试剂作空白，在470～530nm波长范围内测定吸光度[8]。以波长(λ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作图，得吸收曲线。
1.3.2.3 标准曲线的制作 分别取上述芦丁标准溶液0.00mL，0.50mL，0.60mL，0.90mL，1.20mL，1.50mL，1.80mL于7只10mL比色管中，按照“1.3.2.2吸收曲线的制作”项下显色，在最大吸收波长处测定各溶液的吸光度A值，以浓度C对吸光度A作图，得回归方程A=bC+a。
1.3.3 供试液的制备
取景天三七药材干燥粉末18份，每份0.2g，均精密称定，分为6组，各组分别加入水、无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和60%乙醇各15mL，浸泡过夜。水提取条件为沸水浴，不同浓度乙醇液的提取温度为水浴75℃，提取60min，冷却后，吸取上清液。再加入各提取溶剂10mL，再次提取60min。合并两次提取液，定容至25.00mL，摇匀，备用。
1.3.4 样品含量测定 分别精密吸取上述供试液2.00mL，按“1.3.2.3标准曲线的制作”项下显色和测定。同时精密吸取供试液2.00mL于10mL比色管中，不加显色剂，其余同上，最后加蒸馏水稀释至刻度，作为试样空白。测得各供试液的吸光度，通过标准曲线计算总黄酮含量。
学海网(www.xuehai.net)2 结果
2.1 样品溶液中黄酮类化合物检识
通过“1.3.1样品溶液中黄酮类化合物检识”可以证明景天三七中含有黄酮类成分。
2.2 吸收曲线 从吸收曲线得出，样品显色后在508nm处有最大吸光度，故选择此波长为测定波长。
2.3 标准曲线 按照“1.3.2.3标准曲线的制作”项中的方法显色操作，在波长508nm处测得各标准溶液的吸光度A值，以浓度C对吸光度A进行回归，得回归方程A= 0.011 9C-0.039 5，(C：μg?mL-1)，r=0.999 7(n=5)。结果表明在15.20～45.60 μg? mL-1的范围内，浓度与吸光度呈良好的线形关系。
2.4 不同溶剂对景天三七中总黄酮提取的影响 按“1.3.4样品含量测定”项下操作，根据标准曲线计算出样品含量。经统计学处理，80%乙醇为溶剂、75℃水浴条件下提取的总黄酮含量最高(t检验，P<0.05)(表1)。表1 不同溶剂对景天三七总黄酮提取的影响
2.5 样品含量测定 以80%乙醇为溶剂，在75℃水浴条件下提取，得总黄酮平均含量为(18.39±0.40)mg?g-1，相对标准偏差(RSD)为2.2%(n=5)(表2)。表2 样品测定结果
2.6 重复性试验 取同一批药材5份，按“1.3.3供试液的制备”项的方法提取，再按“1.3.4样品含量测定”项下进行分析，按标准曲线计算景天三七中总黄酮的含量，各含量的RSD% 为2.2%(n=5)。
2.7 稳定性试验 按 “1.3.4样品含量测定”项下进行操作，测定同一供试液在不同时间的吸光度。结果表明，吸光度值在显色后60min内基本不变，因此测定应控制在显色60min内完成。
2.8 精密度试验 按“1.3.4样品含量测定”项下操作，对其中一份样品溶液，平行测定5次，代入回归方程，计算景天三七中总黄酮含量，RSD为0.05%(n=5)。
2.9 回收率试验 取已知总黄酮含量的景天三七样品，加入适量芦丁对照品，按“1.3.3供试液的制备”和“1.3.4样品测定”项下进行操作，经计算得平均回收率为95.74%，RSD为0.98%(n=6)。
3 讨论
3.1 我们通过盐酸?裁痉鄯从?和醋酸铅反应，验证了景天三七中确含有黄酮类物质。黄酮类化合物是一类在多种植物中广泛分布的多酚化合物，其具有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎免疫、抗衰老等药理学作用[9]。
3.2 采取水和不同浓度乙醇进行提取，经统计学处理，得出景天三七中黄酮类化合物最佳提取溶剂为80%乙醇(P<0.05)。在此提取条件下，测得景天三七中总黄酮的含量为18.39mg?g-1，RSD为2.2%(n=5)。
3.3 关于景天三七的研究报道相对较少，而更多有关有效成分分析和药理药效等方面的工作，有待今后进一步研究。
【参考文献】
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3 国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册[M].北京：人民卫生出版社,1986.476.
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5 付煜荣,王欢,章立波,等.土三七中多糖提取条件的优化及含量测定[J].中成药,2009,31(11):51.
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9 邹浩军，明亮.黄酮类化合物抗炎免疫及抗衰老药理研究进展[J].安徽卫生技术学院学报，2003,2(6)：48??50,57.
