HPLC法测定乙肝清热解毒片中两种黄酮类成分的含量
【摘要】 目的 建立以高效液相色谱（HPLC）法同时测定乙肝清热解毒片中两种黄酮类成分（槲皮素、山奈素）含量的方法。方法 色谱柱为伊利特-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60），检测波长为370nm，流速为1.0ml/min，进样量为20μl，柱温为35℃。结果 槲皮素、山奈素检测浓度的线性范围分别为4.2～25.2μg/ml（r=0.9994）、0.97～5.82μg/ml（r=0.9996）；平均回收率分别为97.56%，98.76%，RSD分别为1.62%，1.52%。结论 本法快速、简便、准确、重现性好，可用于乙肝清热解毒片的质量控制。
【关键词】 乙肝清热解毒片 色谱法 高压液相 槲皮素 山奈素 质量控制
乙型肝炎病毒携带者，症见黄疸（或无黄疸）、发烧（或低烧）、舌质红、舌苔厚腻、脉弦滑数、口干苦或黏臭、厌油、胃肠不适等。学海网(www.xuehai.net)乙肝清热解毒片是由虎杖、茵陈、北豆根、白花蛇舌草、甘草、拳参等制成，用于肝胆湿热型急、慢性病毒性乙型肝炎初期或活动期的治疗。其中白花蛇舌草为重要组成成分，其活性成分黄酮类化合物有清热、解毒、活血、利尿的功效，可用于治疗各种癌症及炎症［1］。乙肝清热解毒片中黄酮类化合物的含量测定文献报道少见，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定乙肝清热解毒片中槲皮素、山奈素的含量，为评价乙肝清热解毒片的质量提供科学依据。
1 仪器与试药
美国Agilent HP1100系列高效液相色谱仪（包括Agilent G1310A单元泵、Agilent G1316A柱温箱、Agilent G1314A可变波长检测器）；威马龙工作站；TDX高速离心机（美国Abbott公司）；电子精密天平(Ohaus)；KS1500超声清洗器(宁波科胜仪器厂)。
槲皮素、山奈素对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：100081-200406，l10861-200304）；乙肝清热解毒片（山东海森药业有限公司，批号：20070201，20070501，20070604）；乙腈、甲醇为色谱纯；水为双蒸水；其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：伊利特-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60）；检测波长：370nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样量：20μl。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取经五氧化二磷干燥12h的槲皮素、山奈素对照品适量，加甲醇制成含槲皮素1.05mg/ml、山奈素0.2425 mg/ml的混合对照品贮备液，备用。取混合对照品贮备液0.08ml于10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取乙肝清热解毒片20片，研细，精密称取粉末约5g，置烧瓶中，加入甲醇20ml和盐酸1ml，摇匀，置水浴中加热回流2h，迅速冷却到室温，滤过，滤液转移入25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即可。
2.4 阴性样品溶液的制备
取不含白花蛇舌草的空白片，按“2.3”项下方法制备不含白花蛇舌草的阴性样品溶液。
2.5 专属性试验
分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明空白溶液色谱图在槲皮素、山奈素保留时间处未显示色谱峰，专属性良好。色谱见图1。
2.6 线性关系考察
分别精密吸取对照品贮备液0.04、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20、0.24ml于10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，制成系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，以峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，得槲皮素、山奈素的回归方程分别为A=62498C+4392（r=0.9994）、A=67443C+3071.7（r=0.9996）。结果表明：槲皮素、山奈素检测浓度线性范围分别为4.2～25.2μg/ml和0.97～5.82μg/ml。
学海网(www.xuehai.net)2.7 精密度试验
取对照品溶液20μl，于室温下放置0、2、4、6、8、24h后进行测定，结果槲皮素、山奈素的RSD分别为0.69%、0.50%，表明日内精密度良好。取同一份对照品溶液于0、1、2、3、4天测定，结果槲皮素、山奈素的RSD分别为0.78%、0.62%，表明日间精密度良好。
2.8 稳定性试验
取供试品溶液（批号：20070501）于0、2、4、6、8、24h进行测定，结果槲皮素、山奈素的RSD分别为0.83%、1.10%，表明样品在24h内稳定。
2.9 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品5g，加入一定量的槲皮素、山奈素对照品，按供试品溶液制备方法操作，得加样回收测定溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表1。表1 回收率试验结果（略）
2.10 样品含量测定
分别取3批乙肝清热解毒片，同“2. 3”项下方法，制备供试品溶液，进样测定，结果见表2。表2 样品含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 本实验采用甲醇提取与盐酸甲醇提取进行比较，结果经盐酸甲醇提取的槲皮素、山奈素含量明显高于甲醇提取。故选择盐酸甲醇水解法。
3.2 文献报道槲皮素的检测波长为360nm［2］和370nm［3］，本实验取对照品甲醇溶液，以甲醇为空白，自200～450nm作紫外线扫描，在370nm处均有最大吸收，且峰顶延缓。故选370nm为检测波长。
3.3 通过对不同甲醇—0.2%磷酸比例的流动相进行选择，结果发现槲皮素、山奈素保留时间随甲醇浓度增大而缩短，加入适量乙腈能达到更好的分离效果，选择乙腈—甲醇—0.2%磷酸（10∶45∶60）为流动相，分析时间适中，且样品中槲皮素、山奈素达到良好的分离。
3.4 采用水浴加热回流提取与超声提取进行比较，结果水浴加热回流提取槲皮素、山奈素含量明显高于超声提取，说明加热更有利于糖苷的水解。
3.5 黄酮类成分在HPLC测定中易出现拖尾现象，在流动相中加入酸类可有效抑制拖尾，提高其峰形的对称性，经多次测定，系统具有良好的重现性和稳定性。
【参考文献】
［1］张海娟，陈业高，黄荣.白花蛇舌草黄酮成分的研究［J］.中药材，2005，28（5）：385-387.
［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：化学工业出版社，2005：257.
［3］孙也之，王琳，刘振，等.高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素的含量［J］.广东药学院学报，2007，23（1）：5-6.
