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硕士论文-猪源大肠杆菌耐药性调查与Ⅰ型整合子-基因盒分子流行病学研究，共71页，40261字
摘 要
细菌耐药性问题已经成为全球关注的一个热点。大肠杆菌作为人和动物体内的常在
菌，其耐药水平的高低具有一定的代表性。存在于细菌质粒中的整合子结构，能够整合
各种耐药基因盒并在同种或不同种细菌间进行水平传播，进而引起细菌耐药性普遍升高
和多重耐药日趋严重的现状。因此了解规模化养猪场大肠杆菌的耐药水平，研究Ⅰ型整
合子的的类型及其流行状况，分析其耐药基因盒与多重耐药现象之间的关系，为了解细
菌耐药性现状，指导临床合理用药以及针对目前耐药现状制定防控措施提供试验依据。
本研究采用微量肉汤稀释法测定 159 株猪源大肠杆菌对 8 类 14 种抗菌药物的耐药
性。试验结果表明：159 株大肠杆菌对四环素、磺胺异恶唑、新诺明的耐药率最高，为
100%；所有菌株对奥格门丁均表现为敏感；而对头孢唑啉、头孢噻呋和多粘菌素的耐
药率较低，分别为 5.03%(8 株)、5.66%(9 株)和 2.52%(2 株)。多重耐药范围为 3 耐~11
耐。其中以 7 耐为最多，耐药菌株的比例占到 24.44%，其次分别为 9 耐、8 耐、6 耐、
5 耐，耐药菌株的比例分别为 17.94%、17.15%、12.93%、12.66%。
本试验采用 PCR 方法调查猪源大肠杆菌Ⅰ型整合子的流行病学，以扩增出 5’端的
保守序列Ⅰ型整合酶基因(intI1 基因)为判定存在Ⅰ型整合子的依据。采用 PCR 方法、PCR
产物同源性酶谱分析及直接测序三种方法结合进行耐药基因盒的调查。研究得出：从猪
场分离的 119 株大肠杆菌中，共 92 株分离菌有Ⅰ型整合子整合酶基因及耐药基因盒插
入区扩增片段，检出率达 77.31%。92 株Ⅰ型整合子携带大肠杆菌共扩增出 7 类不同大
小的基因盒插入区片段，大小分别为 1008bp、1318bp、1586bp、1663bp、1913bp、1945bp、
3149bp，其中以大小为 1008bp 的插入区片段的检出率最高为 31.67%。而检出率最低的
为长度为 1318bp 的基因盒插入区。将基因盒插入区扩增片段的测序结果与 Genebank 中
的相关序列进行比对，分析其携带基因盒的同源性。试验检测的Ⅰ型整合子携带的耐药
基因为 aadA1、aadA2、aadA5、aadA22、aadB、dfrA1、dfrA12、dfrA17、dfrA27、lnuF、
cmlA6、aar-3、orf 分别编码对相应药物的耐药性。
关键词：大肠杆菌；Ⅰ型整合子；基因盒；耐药性；多重耐药；分子流行病学

目录
摘 要............................. 1
Abstract............................. 2
英文缩写词表......................... 3
文献综述............................ 1
1 综述前言............................. 1
2 抗生素的发展历史及现状..................... 1
3 细菌对抗生素耐药现状及其耐药机制的研究进展................ 4
4 细菌耐药性传播机制的研究进展...................... 15
试验一 规模化养猪场猪源大肠杆菌耐药性的................... 22
1、材料与方法.......................... 22
1.1 材料........................... 22
1.1.1 培养基及试剂....................... 22
1.1.2 抗菌药物.......................... 22
1.1.3 质控菌株.......................... 22
1.1.5 主要仪器与设备......................... 22
1.2 方法............................ 23
1.2.1 样品采集........................... 23
1.2.2 大肠杆菌的分离......................... 23
1.2.3 大肠杆菌的鉴定......................... 23
1.2.4 大肠杆菌的保存......................... 23
1.2.5 大肠杆菌对 14 种抗菌药物体外敏感性试验.............. 23
2、结果与分析.......................... 25
2.1 大肠杆菌分离情况........................ 25
2.2 两地区养殖场分离株的耐药率情况..................... 25
2.3 两地区养殖场耐药菌株的多重耐药情况.................. 28
2.4 同一养殖场，不同日龄猪耐药率情况................. 30
2.5 同一养殖场，不同日龄猪耐药菌株多重耐药情况比较.............. 32
3 讨论.............................. 35
3.1 细菌耐药性检测的试验方法....................... 35
3.2 耐药水平不断提高........................ 35
3.3 两地区养殖场耐药水平的差异................... 36
3.4 耐药现状指导临床用药..................... 36
试验二 猪源大肠杆菌Ⅰ型整合子-基因盒的分子流行病学研究 .............. 37
1、材料与方法.......................... 37
1.1 材料.......................... 37
1.1.1 菌株......................... 37
1.1.2 试剂......................... 37
1.1.3 主要仪器设备........................ 39
1.2方法............................. 39
1.2.1PCR 检测Ⅰ型整合子及基因盒................. 39
1.2.2PCR 产物电泳分析及回收 ................... 41
1.2.3 基因盒插入区目的片段的连接及转化................... 42
1.2.4 基因盒插入区片段的测序................... 44
1.2.5 同类大小基因盒插入区片段的酶谱分析............... 44
2 结果与分析............................ 45
2.1 猪场大肠杆菌Ⅰ型整合子检出情况..................... 45
2.2 基因盒插入区 PCR 扩增结果及猪场大肠杆菌Ⅰ型整合子流行种类........... 45
2.2.1 猪场分离大肠杆菌Ⅰ型整合子基因盒插入区 PCR 扩增结果........... 45
2.2.2 各种基因盒插入区片段测序及酶切图谱分析................. 47
2.2.3 各种Ⅰ型整合子检出菌的流行情况.................. 48
2.3 各类Ⅰ型整合子整合的耐药基因盒.................... 49
2.3.1 插入基因盒与 Genebank 数据库登录的相近基因盒同源性比较 .......... 49
2.3.2Ⅰ型整合子的各类耐药基因盒的流行情况................. 52
3.讨论.......................... 54
3.1Ⅰ型整合子的 PCR 检测方法 ..................... 54
3.2Ⅰ型整合子的检出率..................... 54
3.3 多重耐药表型与基因盒的相关性................... 55
全文总结.......................... 56
参考文献.......................... 60