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硕士论文-玉米核糖体失活蛋白基因z108在大肠杆菌中的表达及在烟草和番茄的转化研究，共72页，32623字
摘要
核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating Proteins，RIPs）是一类在高等植物中广
泛存在的毒蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性，可特异地水解掉28S rRNA 3’端茎环结构
的一个腺甘酸，阻止核糖体与延伸因子EF-Tu和EF-G的结合及多肽链的延伸，从而抑
制靶细胞中蛋白质的合成。
研究表明，RIP 具有广谱的抗病毒作用，它可以使病毒的核糖体失活，能有效阻
止病毒侵染，已被广泛用于抗病毒基因工程研究，目前，已有 50 多种植物中的 60
多种不同的核糖体失活蛋白基因被分离、克隆出来，并在烟草、番茄、马铃薯和水稻
等植物中表达，获得抗病毒转基因植株。
根据核糖体失活蛋白的分子结构，可将其分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类。玉米核糖体失
活蛋白是一种在玉米胚乳中特异表达的双链Ⅰ型 RIP，它首先以无活性的单链前体形
式 b-32 在种子内大量合成，种子萌发时，内源蛋白酶通过酶解作用，除去前体蛋白
b-32 结构中的 N、C 末端以及中间部位的氨基酸序列。目前有关玉米核糖体失活蛋白
的功能和作用机制仍不清楚。
为进行抗病毒基因工程及玉米核糖体失活蛋白抗病机制研究，本实验室从玉米
（Zea Mays L）品种农大 108 胚芽中分离克隆得到了玉米核糖体失活蛋白基因 z108，
其开放阅读框为 903 个碱基对，编码蛋白 301 个氨基酸，与 Bass(1995)发表的核苷酸
序列的同源性为 98.6%，是一个 b-32-like 基因。本研究将包含开放阅读框在内的玉
米核糖体失活蛋白基因片段插入到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)的多克隆位点中，诱
导 其 在 大 肠 杆 菌 菌 株 BL21(DE3) 中 表 达， 并 由 农 杆 菌 介 导 叶 盘 法 转 化 烟 草
（Nicotiana.tobaccum.L )K326 和番茄(Lycopersicon esculentum Mill)品种 97-4、樱红
(Lycopersicon esculentum var. cerasiforme)，为今后开展抗病机制方面的研究奠定了坚
实的基础。其研究结果如下：
1) 将包含开放阅读框在内的基因片段插入到大肠杆菌表达载体 pET30a(+)的多
克隆位点上，并转化大肠杆菌菌株 BL21(DE3)，37℃培养细菌至对数生长期以后， 26
℃诱导表达 3h。SDS-PAGE 电泳检测结果表明，玉米核糖体失活蛋白基因 z108 已在大
肠杆菌菌株 BL21(DE3)中获得表达，表达产物为一重组蛋白，分子量大小为 52.1KD。
这是国内首次在原核生物体中表达玉米核糖体失活蛋白基因及其编码蛋白。
2) 将玉米核糖体失活蛋白基因 z108 插入到双元载体 pCambia1301 的 NcoI 位点
上，以根癌农杆菌 EHA105 为介导进行基因转化，分别在烟草和番茄中表达了该基因，
在含有潮霉素的筛选培养基上，4 个转化菌株 pCam91-3-3 、pCam92-11-3、pCam91-5-1
和 pCam92-6-1 转化烟草的抗性不定芽分化率达到了 57.45-62.79%，而不含有该基因
的空载载体 pCambia1301 在烟草上的转化率 75.34%；转化菌株 pCam91-3-3 在番茄
品种樱红和 97-4 上的转化率分别达到了 21.57%,22.67%，不含有该基因的空载载体
pCambia1301 在樱红和 97-4 上的转化率为 23.08%，35.82%。
3) 根据已发表的基因序列，设计特异引物，随机对于烟草转化体 91-3-3 的 5 个
植株进行 PCR 扩增, 结果表明，5 个转化体中均有插入基因序列的表达，这表明，经
过潮霉素筛选的转化体植株均含有目标基因的插入。
4) 通过组织染色的方法对于表达基因进行 Gus 基因表达的检测，可以观察到，
Gus 基因可以在烟草转化体 91-3-3 的叶片的叶肉细胞和根毛细胞的内溶物中表达，而
pCambia1301 的烟草转化体，仅仅观察到了 Gus 基因在叶片表皮细胞的表达，由于目
标基因的插入是与 Gus 基因紧密连锁的，z108 和 Gus 基因构成融合基因，并且在 35S
启动子的调控之下，因此，Gus 基因的表达，证实目标基因 z108 的组织表达具有特
异性。
关键词：
玉米核糖体失活蛋白；基因转化；烟草；番茄
目录
前言..........1
第一章、文献综述 ...1
1 植物抗病毒基因工程研究进展 ....1
1.1 病毒基因介导的抗病毒基因工程研究.....2
1.2 寄主基因介导的抗病毒基因工程研究.....3
1.2.1 植物的抗病基因的遗传转化研究..........3
1.2.2 核糖体失活蛋白的遗传转化研究..........3
1.2.3 病程相关蛋白基因的遗传转化研究......4
1.3 病毒和寄主以外的基因介导的抗病毒基因工程研究........4
1.3.1 植物抗体基因的遗传转化研究 4
2 核糖体失活蛋白研究进展及其应用............4
2.1 核糖体失活蛋白的结构类型 .......5
2.2 核糖体失活蛋白的功能及加工特点.........5
2.3 核糖体失活蛋白在植物抗病毒基因工程的应用 ..6
2.3.1 商陆抗病毒蛋白...........6
2.3.2 天花粉蛋白 .....7
2.3.3 玉米核糖体失活蛋白...7
第二章、材料与方法 ............9
1 材料...........9
1.1 植物材料 ............9
1.2 菌种和质粒 ........9
1.3 药品与主要试剂 9
2 方法..........9
2.1 玉米核糖体失活蛋白在大肠杆菌中的表达 ..........9
2.1.1 表达载体的插入序列图 ............9
2.1.2 表达产物的诱导...........9
2.1.3 表达产物的鉴定与纯化 ..........10
2.1.3.1 表达产物的鉴定.......10
2.1.3.2 表达产物的分析.......10
2.1.3.3 表达产物的纯化.......11
2.1.4 纯化蛋白的浓度测定及差异显著性分析 ..........11
2.1.5 SDS-PAGE 电泳 .......11
2.2 农杆菌 EHA105 的转化及菌液的制备...12
2.2.1 感受态细胞的制备及质粒 DNA 的转化 ...........12
2.2.2 菌液的制备 ....13
2.3 烟草的植株再生与基因转化 .....13
2.3.1 烟草的植株再生..........13
2.3.2 潮霉素筛选浓度的确定 ...........14
2.3.3 烟草的基因转化..........14
2.3.4 烟草转化体的筛选与植株再生 ............14
2.4 番茄的植株再生与基因转化 .....15
2.4.1 番茄无菌苗的获得.....15
2.4.2 番茄的植株再生 ........ 15
2.4.3 番茄的基因转化 ........ 16
2.5 转基因植株的检测与分子鉴定 ............ 16
2.5.1 转基因植株总 DNA 的提取 ... 16
2.5.2 转基因植株的 PCR 检测 ...... 17
2.5.3 转基因植株的 Gus 基因检测方法....... 17
1 玉米核糖体失活基因在大肠杆菌中的表达............ 19
1.1 表达产物的诱导及分析 ............ 19
1.2 表达产物的分离与纯化 ............ 20
1.3 纯化蛋白的浓度测定及差异显著性分析 ............ 20
2 玉米核糖体失活蛋白基因在烟草中的表达............ 21
2.1 烟草的植株再生 ........... 21
2.2 潮霉素筛选浓度的确定 22
2.3 转化体的筛选与植株再生.......... 22
3 玉米核糖体失活蛋白基因在番茄中表达的研究.... 24
3.1 番茄转化体系的建立 .... 24
3.2 潮霉素筛选浓度的确定 25
3.3 农杆菌菌液浓度和侵染时间对番茄基因转化的影响 ...... 27
3.3.1 农杆菌菌液浓度对番茄基因转化的影响.......... 27
3.3.2 侵染时间对番茄基因转化的影响 ........ 28
3.4 转化体的筛选... 28
4 转基因植株的分子检测 ... 28
4.1 转基因烟草的分子鉴定 28
4.2 烟草转基因植株的组织化学鉴定 ........... 29
第四章、讨论......... 31
1 玉米核糖体失活蛋白基因在大肠杆菌中获得表达 ............ 31
2 玉米核糖体失活蛋白基因在烟草和番茄中获得表达 ........ 31
3 影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素........ 32
4 番茄转化中存在的褐变问题......... 33
5 预培养和共培养时间对番茄基因转化的影响........ 34
6 本研究中基因转化的特点 ............ 35
7 玉米核糖体失活蛋白基因表达的特点 ...... 36
第五章 结论....... 37
1 玉米核糖体失活蛋白基因 z108 在大肠杆菌 BL21（DE3）中获得表达 ..... 37
2 烟草 K326 和番茄品种樱红和 97-4 再生体系的建立 ......... 37
3 烟草和番茄的基因转化 ... 37
4 烟草转化体的 PCR 检测 .. 38
5 烟草转化体的 Gus 基因检测 ........ 38
参考文献 ... 39
将要发表的文章..... 45
附录 ........... 47
附图 ........... 51