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硕士毕业论文 重组线虫抗凝肽的表达与纯化 共59页，31850字
摘 要
线虫抗凝肽（nematode anticoagulant peptide，NAP）是自犬钩口线虫成虫体内分离得到的一系列具有抗凝作用的小分子多肽类物质，每个多肽约含75～85个氨基酸，拥有22%的共同序列。由于其突出的抗凝活性，NAP已显示出其在新型抗凝药物中的开发潜力。已发现的NAP家族成员主要包括NAP1、NAPc2、NAPc3、 NAPc4、NAP5、NAP6、NAP7等, 其中NAP5的抗凝活性最强。
NAP5含77个氨基酸，分子量为8.7KD，可选择性地直接与凝血因子Ⅹ/Ⅹa的活性位点结合来抑制其活性，具有丝氨酸蛋白酶抑制作用，可抑制凝血酶原酶的形成[3]，因而在脓毒血症、弥散性血管内凝血（DIC）、膝关节完全置换术后防治静脉血栓栓塞等急性血小板相关性动、静脉血栓的预防和治疗中具有良好的临床应用前景。由于从线虫中难以提取大量的高纯度抗凝肽，因此研究其基因重组生产技术具有重要意义。本研究将在前期工作的基础上对NAP5在E.coli和毕赤巴斯德酵母（Pichia pastoris）中的表达纯化进行了研究, 以期能大量生产具有天然生物活性的NAP，为其开发利用打下基础。
1 重组线虫抗凝肽在E.coli中的表达与纯化
在前期的研究中，本课题组成功构建了表达含有8个组氨酸(Histidine，His)纯化标签的硫氧还原蛋白（Thioredoxin, TRX）融合蛋白质粒pET11a/His-TRX-rNAP，并在E.coli BL21（DE3）菌株中进行了高效可溶性融合表达。融合蛋白在His-TRX与rNAP之间设计有羟胺切割位点。在此基础上，本研究首先进行了最适培养基的筛选，发现LB培养基最为合适。在此基础上进行了工程菌的发酵研究，确定了发酵的最佳条件，发酵所得菌体湿重产量达到5g/L，产量约为摇瓶中湿菌产量的4～5倍左右，融合蛋白的表达量达到菌体蛋白总量的30％左右。因蛋白是可溶性表达，超声裂解菌体后收集上清，依次经过加热初纯化、阴离子交换或镍柱亲和层析精纯化，得到融合蛋白His-TRX-rNAP纯度达到95～98％，回收率65～70％左右。将纯化后的融合蛋白用羟胺进行位点特异性裂解，去除rNAP N端的His-TRX蛋白标签，然后以阴离子交换层析或凝胶过滤层析纯化rNAP, 得到目的蛋白rNAP的纯度达到80％，回收率30％左右。
2 重组线虫抗凝肽在毕赤酵母中的表达与纯化
由于原核表达产物的纯化较为繁琐，利用本课题组前期构建的表达质粒pPIC3.5K-rNAP，我们在毕赤酵母（Pichia pastoris）中进行了外分泌表达。将pPIC3.5K-rNAP转化酵母菌株GS115后，用His缺陷平板培养基和抗生素G418筛选出含有高拷贝NAP基因的菌株。目的基因在重组酵母菌株中的存在被PCR证实。通过竞争抑制性ELISA筛选出rNAP高表达株，收集培养上清经超滤浓缩后进行SDS-PAGE和Western blot检测，确定表达产物正确。将培养上清浓缩后用Superdex75进行凝胶过滤层析纯化，得到目的蛋白rNAP 的纯度达到85％左右，回收率为60％左右。
3重组线虫抗凝肽的活性检测
将纯化后的蛋白分别用PBS稀释，按不同比例加入正常人血浆中，测定凝血酶原时间（PT）及活化的部分凝血活酶时间 (APTT)。结果显示，当原核表达rNAP浓度为0.996 mg/L（即114nmol/L）时，PT为正常参考值的2倍；0.492mg/L（即55.7nmol/L）时，APTT为正常参考值的2倍。当酵母表达rNAP浓度为1.21 mg/L（即139nmol/L）时，PT为正常参考值的2倍；0.598mg/L（即67.9nmol/L）时，APTT为正常参考值的2倍。这些结果与文献报道的天然NAP5活性接近，证实rNAP5对内、外源凝血途径均有抑制作用。
综上所述，本研究成功地在E.coli中融合表达了rNAP5蛋白，初步建立了表达菌发酵、融合蛋白的纯化、羟胺位点特异性裂解融合蛋白以及目的蛋白rNAP5的纯化的工艺；同时在Pichia pastoris中分泌表达了rNAP5蛋白，并初步建立了纯化工艺。活性检测证实纯化后的重组rNAP5具有与天然产物类似的抗凝活性，这些工作为NAP作为抗凝药物的进一步开发利用打下了基础。有关研究国内未见报道。
关键词 线虫抗凝肽，大肠杆菌，毕赤酵母，表达， 纯化，抗凝活性

目 录
中文摘要…………………………………………………………………………….2
英文摘要…………………………………………………………………………….4
英文缩略词表……………………………………………………………………….7
前言………………………………………………………………………………….8
第一部分：重组线虫抗凝肽在E.coli中的表达与纯化.……………………....11
材料……………………………………………………………………………11
方法……………………………………………………………………………12
结果……………………………………………………………………………18
讨论……………………………………………………………………………27
结论……………………………………………………………………………30
第二部分：线虫抗凝肽在毕赤酵母中的表达与纯化…………………………....31
材料……………………………………………………………………………31
方法…………………………………………………………………………....32
结果…………………………………………………………………………....38
讨论……………………………………………………………………………43
结论……………………………………………………………………………45
参考文献……………………………………………………………………………47
综述：线虫抗凝肽的研究进展……………………………………………………50
参考文献………………………………………………………………………55
攻读学位期间的研究成果…………………………………………………………58
致谢…………………………………………………………………………………59