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硕士论文-牛α1-抗胰蛋白酶基因多态性及其与产奶性状的关系，共72页，35853字
摘 要
α1-抗胰蛋白酶(Alpha 1- Antitrypsin，α1- AT)可通过抑制蛋白酶活性从而保护乳
蛋白的完整性。本研究以中国荷斯坦奶牛为研究对象，以α1-抗胰蛋白酶基因为奶牛生产
性状候选基因，采用DNA测序、PCR-RFLP等技术，进行了该基因单核苷酸多态性（single
nucleotide polymorphism, SNP）与生产性状的关联性分析,以及5′侧翼区不同单倍型组
合对生产性状的影响分析，为奶牛繁殖育种提供了一定的理论依据。研究结果如下：
1.以294头中国荷斯坦牛为研究对象,扩增5′侧翼区668 bp和999 bp的片断并进行测
序，首次发现：在第3,142 bp处P1和第4,408 bp处P2分别发生C-T、T-C突变，随后采用PCR-RFLP
方法对样本进行了检测，进行遗传变异和产奶性状分析。结果显示：两个位点的等位基因
(A/ B,E / F)在群体中都有分布，且处于中度多态。P1位点A和B等位基因的频率分别为50.34
%和49.66 % ;AA,AB和BB基因型频率分别为23.81 % , 53.06 %和23.13 %；P2位点E和F等位
基因的频率分别为30.61 %和69.39 %，EE，EF，FF基因型频率分别为11.90 %,37.41 %和50.68
%.χ2适合性检验表明，该群体在P1位点的突变达到Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），在
P2位点未达到平衡.基因与产奶性状关联分析表明：AB基因型个体产奶量与脂蛋比显著高于
AA基因型个体(P＜0.05)；FF基因型个体乳蛋白率显著高于EF基因型个体(P＜0.05)；9种单
倍型组合与乳脂率、乳蛋白率、体细胞数、产奶量及脂蛋比均存在不同程度的相关性.
2.以 360 头中国荷斯坦牛为研究对象，扩增该基因 5’侧翼区之外的 816bp、926bp、
752bp 的序列进行研究，发现 C7646T、C7706A 、A8744T 、C8935T 、C8178T 五处突变，
除 C8178T 外均为新发现的位点。五个位点的等位基因在群体中都有分布，除 C7646T 外的
四个位点均呈中度多态。C7646T 处 A 等位基因频率为 94.69%，处于绝对优势。χ2 适合性
检验表明，C7706A 处于 Hardy-Weinberg 平衡状态(P>0.05)。在随后的基因型与生产数据
的相关分析中，我们发现，对于 C7706A 形成的三种基因型，在产奶量上有 CC>CD>DD，CC
与 DD 差异达显著水平（P<0.05），体细胞评分 DD>CD>CC，CC 与 DD 差异显著（P<0.05）；
C8935T 形成的三种基因型，在乳蛋白率上有 MM>MN>NN，MM 与 NN 差异显著（P<0.05）。
整项研究工作，我们重点关注了奶牛α1-抗胰蛋白酶基因七处突变位点，除 C8178T 外
均为新发现的位点。对七个位点均进行了群体遗传参数的分析，并对 C3142T、T4408C 多态
性与产奶量、乳蛋白率、乳脂率、脂蛋比做了关联性分析，对 C7706A、C8935T 多态性与产
奶量、乳蛋白率、乳脂率、体细胞评分做了相关分析。找到了 B、F 、C、M 四个对于奶牛
生产指标具有有利作用的等位基因，从而作为分子遗传标记为奶牛的分子育种提供理论参
考。在对 5’侧翼区两处突变形成的单倍型组合研究中，我们发现 H7（AAFF）体细胞数高、
产奶量低，与 H8（ABFF）相比，两项均达极显著水平。
关键词 中国荷斯坦牛;α1-抗胰蛋白酶基因;多态性;PCR-RFLP;产奶性状
目 录
中文摘要............... 1
英文摘要............... 3
文献综述............... 6
一 我国牛奶行业与奶牛育种概况......... 6
1 我国牛奶产业现状.................... 6
2 奶牛育种工作的进程................ 7
二 分子标记与 SNP 技术综述................ 8
1 分子标记技术的研究进展................... 8
2 单核苷酸多态性（SNP）的研究进展.......... 10
三 奶牛产奶性状候选基因研究进展............... 14
1 产奶性状 QTL 定位 ............... 14
2 产奶性状候选基因研究进展............. 15
正文................. 21
前言................. 21
第一部分 奶牛 α1-抗胰蛋白酶基因 5′侧翼区多态性与产奶性状关联性分析...... 22
1 材料与试剂................. 22
1.1 实验材料.................. 22
1.2 主要仪器设备...................... 22
1.3 主要分子生物学软件.......... 24
1.4 实验主要试剂...................... 24
1.5 主要试剂的配制.................. 25
2 实验方法和步骤..................... 27
2.1 奶牛 DNA 的提取 ............... 27
2.2 α1-AT 基因 5′侧翼区多态性的寻找......... 28
2.3 α1-AT 基因 5′侧翼区 SNP 位点多态性检测 ....... 31
2.4 数据统计分析...................... 32
3 结果与分析................. 34
3.1 基因组 DNA 的提取 ........... 34
3.2 PCR 扩增产物检测结果 .................. 35
3.3 测序结果.................. 36
3.4 酶切检测结果...................... 37
3.5 荷斯坦牛 α1-AT 基因型频率、基因频率............... 38
3.6 荷斯坦奶牛 α1-AT 基因 5′侧翼区 2 个座位的群体遗传特性.............. 39
3.7 连锁不平衡检验与单倍型频率.................. 39
3.8 α1-AT 基因多态性与荷斯坦牛产奶性状的关联分析........ 40
3.9 α1-AT 基因 5′侧翼区多态位点的单倍型组合分析........ 40
4 讨 论............... 41
4.1 实验材料的采集、处理和保存 .................. 41
4.2 DNA 提取方法的优化 ..................... 42
4.3 关于 PCR 反应 .................... 42
4.4 关于基因的 5′侧翼区................... 43
4.5 α1-AT 基因 5′侧翼区多态性及与产奶性状的关系......... 44
4.6 α1-AT 基因 5′侧翼区的单倍型分析......... 45
第二部分 中国荷斯坦牛 α1-AT 基因编码区基因多态性与产奶性状关联性分析 ... 46
1 材料与试剂................. 46
2 实验方法和步骤..................... 46
2.1 引物设计.................. 46
2.2 PCR 体系 .................. 47
2.3 目的片段测序...................... 47
2.4 PCR 产物酶切及基因分型 .............. 47
2.5 数据的统计处理.................. 48
3 结果与分析................. 48
3.1 PCR 产物检测结果 .............. 48
3.2 测序分析.................. 49
3.3 酶切检测结果...................... 50
3.4 基因频率、基因型频率.................. 52
3.5 α1-AT 基因 5 个基因座的多态信息含量、杂合度及有效等位基因数 .... 53
3.6 α1-AT 基因多态性与产奶性状的相关性................ 54
4 讨论................. 55
4.1 α1-AT 基因 5 个基因座的群体遗传特性............... 55
4.2 α1-AT 基因与奶牛产奶性状的相关性........ 55
全文总结............. 57
参考文献............. 58
致 谢………………………………………...63