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硕士论文-利用RNAi技术沉默玉米sbeⅡb的研究，共59页，30118字
摘 要
玉米是一种重要的粮食和经济作物，种植和应用比较广泛，玉米籽粒中含有
直链淀粉和直链淀粉。在工业方面，直链淀粉是重要的工业原料，可用于生产生
物降解薄膜、胶卷、高级包装材料、工业酒精以及作为纺织加浆的原料。在食品
制作方面，直链淀粉属于抗消化淀粉，食用后人体血糖水平不易升高，可用于糖
尿病、肥胖、高血压、胆结石等病人的保健食品。从普通玉米淀粉中提取直链淀
粉的成本很高，只有高直链玉米淀粉才具有商业开发价值。高直链玉米淀粉在美
国和欧洲已经商品化，我国还没有高直链玉米淀粉品种规模化商业种植。
本文利用 RNAi 技术沉默玉米 sbeⅡb，提高玉米直链淀粉的含量，进行研究，
同时建立农杆菌介导的优良玉米自交系的遗传转化体系，对玉米基因工程育种具
有十分重要的意义。本文主要研究结果如下：
1
玉米幼胚是目前遗传转化中应用最多的外植体。以 5 个玉米自交系丹黄 25、
P138、陕 814、齐 319、H21 为材料，通过实验优化了玉米幼胚继代培养基，对
5 个自交系幼胚诱导情况进行了方差分析。对幼胚培养过程中的出现的褐化现象
进行了分析，通过控制胚龄长短和在继代培养基中添加某些成分抑制愈伤组织的
褐化，提高幼胚愈伤组织的活性。结果表明，基因型不同的玉米自交系，胚龄时
间为 9-15 天接种，在丹黄 25 胚龄 11 天，H21 和 P138 胚龄 13 天时活力较强，
褐化率较低，继代培养基中加入 2mg/L 的 2,4-D，10g/L 的甘露醇，10mg/L 的脯
氨酸和硝酸银的作用下，抑制褐化作用显著。
2 利用 pBAC3300、pBAC407、pBAC413 构建新质粒，将 sbeⅡb 的部分序列及
启动子作为 RNAi 的目标序列，构建 pQAU1 和 pQAU2 载体。将构建好的载体
转化到大肠杆菌中进行扩繁，提取质粒进行酶切片端验证。
3 建立农杆菌介导的优良玉米自交系的遗传转化体系，并优化农杆菌 LBA4404
侵染幼胚的条件，在菌液的 OD 值为 0.5，AS 浓度为 10mmol/L,侵染时间为
20mins，幼胚培养时间根据基因型可能产生差异，但是丹黄 25 和陕 814 幼胚培
养 23 天，避光恒温恢复培养 72h，幼胚愈伤组织的活性较好。
4 筛选抗性愈伤组织后，配制分化培养基，生根壮苗培养基，促进愈伤组织分化
成苗。以 pBAC3300 质粒中存在的 FAD2 intron 基因构建引物，提取幼苗的总 D
NA，以特定 FAD2 intron 基因构建引物进行 PCR 检测。上游引物：5’-AGCAGA
TCTATCGTGAGCGG-3’，下游引物为 5’-GAAGACTCTCTTGAATCGTTACC-3’
经 PCR 反应后，用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，三棵成活的幼苗出现 1.2KB 的
目的条带。
关键词：玉米幼胚；RNAi；根癌农杆菌；sbeⅡb
目 录
摘 要.......…1
英文摘要…………......…….3
第一章.....…6
前 言.....…..6
1 文献综述....……………….6
1.1 玉米淀粉的组成以及合成过程...……….6
1.1.1 直链淀粉和直链淀粉...……………….6
1.1.2 淀粉合成过程....…….6
1.1.3 淀粉分支酶....……….7
1.2 玉米幼胚技术的发展....8
1.2.1 幼胚培养影响因素.....8
1.2.2 愈伤组织三种类型....10
1.2.3 褐化及解决方法........10
1.2.4 玉米幼胚前景展望....11
1.3 农杆菌介导玉米遗传转化...…………...11
1.3.1 农杆菌转化机理....…11
1.3.2 LBA4404....………....13
1.3.3 农杆菌转化进展....…13
1.3.4 介导影响因素....……14
1.4 RNAi 技术....………….14
1.4.1 RNAi 技术的定义和前景...…………..14
1.4.2 RNAi 在玉米上的应用...……………..15
2 本研究的目的、意义和技术路线...…….15
2.1 研究目的和意义....…..16
2.2 研究的技术路线....…..16
第二章 玉米幼胚受体体系的建立...……...17
1 基本实验材料....……….17
1.1 植物材料....…………..17
1.2 培养基制作....………..17
2 处理方法....……………..18
2.1 愈伤组织诱导，继代，分化以及生根培养..…………..18
2.2 试验参数....…………...18
3 结果与分析....…………..18
3.1 不同基因型的幼胚出愈情况...……… ..18
3.2 对愈伤组织褐化情况分析...…………...19
3.2.1 胚龄对褐化的影响....19
3.2.2 2,4-D浓度对褐化的影响...………...…20
3.2.3 甘露醇对褐化的影响...………….…..21
3.2.4 脯氨酸和硝酸银对褐化的影响...…...22
3.3 玉米幼胚的分化、生根和移栽...…….22
4 讨论........24
第三章 根癌农杆菌介导玉米自交系的传转化..…………...26
1 材料与方法....…….…….26
1.1 玉米材料....……..…….27
1.2 菌株和载体....….……..27
2 新载体的构建....….……..28
2.1 新载体....……….……..28
2.2 质粒 DNA 的提取....…29
2.2.1 分光光度法检测 DNA 浓度...……….30
2.2.2 琼脂糖凝胶电泳法....32
2.3 玉米总 DNA 的提取.....32
2.3.1 溶液配制....…………34
2.3.2 CTAB 法....……….…35
2.3.3 总ＤＮＡ检测....….…35
2.4 根癌农杆菌 LBA4404 的转化...……….35
2.4.1 介导转化培养基制作...………………33
2.4.2 根癌农杆菌法转化玉米...……………33
2.5 新质粒的转化与扩繁...………………...35
2.5.1 连接产物的转化....…34
2.5.2 重组质粒的扩繁....…35
2.5.3 酶切反应体系....……35
2.5.4 重组质粒鉴定....……35
2.5.5 重组质粒转化到农杆菌中...…………35
2.6 根癌农杆菌侵染愈伤组织...……………36
2.6.1 菌液 OD600 取值对丹黄 25II 型愈伤组织的影响..……36
2.6.2 不同的 AS 浓度对农杆菌侵染的影响..………………36
2.6.3 不同的继代天数对农杆菌侵染的影响..……………...37
2.6.4 不同的侵染时间对农杆菌侵染的影响..……………...37
2.6.5 不同共培养时间对农杆菌侵染的影响.....……………38
3 讨论.......38
第四章 转基因玉米植株的分子生物学检测..……………...39
1 植物材料....……………..39
2 用于分子生物学鉴定的 PCR 引物...……39
3 转基因后代植株基因组 DNA 的提取...…39
3.1 溶液配制....………...…39
3.2 转基因玉米总 DNA 的提取...………….39
4 转基因植株 FAD2 intron 基因的 PCR 检测..…………….40
5 结果与分析....…………..40
5.1 转基因幼苗叶片 DNA 提取...………….41
5.2 转基因植株 PCR 检测...……………….41
6 讨论.......41
第五章 结 论....…………..42
第六章创新点和后期任务...……………….43
1 创新点....………………...43
2 后期计划....…………….43
参考文献....……………….44