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硕士论文-牛MSCs核移植胚胎发育潜能的研究，共66页，35224字
摘 要
本实验通过贴壁筛选法分离培养牛骨髓间充质干细胞（BMSCs），对分离培养的牛
MSCs 生物学特性进行了分析，并以牛 MSCs 为供核细胞进行了核移植实验，研究了牛
MSCs 核移植重构胚的体外发育能力，同时还对比研究了不同种类供体核的核移植重构
胚在囊胚细胞数上的差异。最后进行胚胎移植，探讨了不同供体细胞对牛核移植重构胚
移植后妊娠率的影响。实验取得以下结果：
1、经纯化培养后的牛 MSCs 形态均一，呈成纤维表型克隆样生长，瑞氏-吉姆萨染
色可见细胞核较大，多为卵圆形，核仁明显，大多数细胞有 2-4 个核仁。碱性磷酸酶（AKP）
染色，可见细胞呈弱阳性，说明分离得到的 MSCs 是一群比较原始的细胞。
2、分别用切割法和抽吸法来获取卵母细胞，切割法所收集的可用卵母细胞数显著
多于抽吸法( P< 0. 05) ,培养后卵母细胞成熟率低于抽吸法但差异不显著。
3、牛卵母细胞成熟液中分别添加 FSH（10μg/L）、ITS (10μl/mL)、EGF (10μg/L)，
配成 3 种不同体外成熟液分别对卵母细胞进行培养，FSH 组第一极体排出率 84.2%高于
ITS 和 EGF 组，差异显著。ITS 组第一极体排出率 75.9%高于 EGF 组 70.2%，但差异不
显著。
4、分别以牛 MSCs, MCs, MECs 为供体核进行核移植， MSCs 组桑葚胚率
（50.4±1.2%）高于 MCs 组（42.7±0.6%） P>0.05）和 MECs 组（32.1±0.9%） P<0.05），
囊胚率（37.2±0.4%）显著高于 MCs 组（21.1±0.8%）和 MECs 组（20.4±0.6%） P<0.05）。
5、对比三种供体细胞的核移植囊胚细胞数，MSCs 组核移植重构胚平均细胞数
（103±1.7）高于 MCs 组（87±2.4）和 MECs 组（76±3.2），接近超排胚胎（对照组）的
细胞数（112±4.8）。
6、对不同供体核的核移植囊胚进行胚胎移植，胚胎移植后的 MSCs 组胚胎在妊娠
的 30~90 天妊娠率高于 MCs 组和 MECs 组，差异显著。
本研究结果显示：牛 MSCs 增殖能力强，生物学性状稳定，易于分离纯化，短时间
可扩增得到大量高纯度的 MSCs，牛 MSCs 支持核移植胚胎的发育，与 MCs 和 MECs
核移植胚胎相比，牛 MSCs 重构胚的桑葚胚率、囊胚率都得到提高，胚胎移植妊娠率显
著高于 MCs 和 MECs 组克隆胚胎。牛 MSCs 是一种较理想的牛核移植供体细胞。
关键词：牛；骨髓间充质干细胞；体外成熟；核移植；胚胎移植
目录
中文摘要......................... 1
英文摘要......................... 2
英文缩写注释 ...................... 4
第一部分
文献综述 .................... 1
前言 ........................... 1
1 哺乳动物核移植研究进展 .................... 1
1.1 核移植里程碑事件 ........................ 1
1.2 牛体细胞核移植研究进展................... 2
1.3 核移植技术路线...................... 4
2 影响体细胞核移植效率的几点因素 .................... 4
2.1 供体细胞对体细胞核移植的影响 ................. 4
2.1.1 供体细胞种类 ...................... 4
2.1.2 供体细胞的细胞周期 ...................... 5
2.1.3 供体细胞的传代次数 ..................... 5
2.1.4 供体细胞年龄 ...................... 5
2.1.5 对供体细胞的特殊处理.................. 6
2.2 受体细胞对体细胞核移植的影响 ................. 6
2.3 核移植方法对体细胞核移植的影响 .................. 7
2.4 卵母细胞去核方法对体细胞核移植的影响.................. 7
2.4.1 盲吸法 ........................ 7
2.4.2 荧光染色法 ...................... 7
2.5 重构胚的体外培养条件对体细胞核移植的影响 .............. 8
3 体细胞核移植中相关问题的研究................... 8
3.1 重构胚基因组的重编程..................... 9
3.2 DNA 甲基化 ....................... 9
3.3 组蛋白乙酰化 .........................10
3.4 端粒 ....................... 10
3.5 线粒体 DNA 的命运................... 11
4 体细胞核移植的应用前景 ...................... 11
4.1 核移植在基础研究中的作用 ..................... 11
4.1.1 转基因动物的制备 ....................... 11
4.1.2 治疗性克隆 ........................ 12
4.2 核移植在实际生产中的作用 ..................... 12
4.3 核移植与种质资源的保护 .................... 12
5 骨髓间充质干细胞(MSCS)的研究概况 .................. 13
5.1 MSCS 的定义 ......................... 13
5.2 MSCS 的分离与培养 ...................13
5.3 MSCS 的生物学特性 ...................13
5.3.1 MSCSs 的形态特征和生长方式 ...................13
5.3.2 MSCs 的细胞周期....................13
5.4 免疫学特性 ...................... 14
5.4.1 免疫原性 ....................... 14
5.4.2 免疫调节性 ......................... 14
5.5 MSCS 的超微结构....................... 14
5.6 MSCS 的表型特征....................... 14
5.7 MSCS 在克隆方面的应用...................... 15
6 本研究的目的和意义 ………………………………………………………………………………….16
第二部分
试验部分 ....................17
试验一：供体细胞的准备 ..................... 17
1 试验材料与耗材 .........................17
2 试验方法 ........................ 19
2.1 主要试剂配制 ........................19
2.2 牛 MSCS 的分离及培养...................19
2.3 牛乳腺上皮细胞的分离及培养..................20
2.4 细胞冷冻和复苏方法 ......................20
2.4.1 细胞的冻存 ........................20
2.4.2 细胞的复苏 ........................21
2.5 生长曲线的测定....................21
2.6 形态学观察 ......................21
2.6.1 瑞氏-吉姆萨（ RS-GMS）染色....................21
2.6.2 碱性磷酸酶（AKP）染色 .................21
3 结果 ......................... 22
3.1 供体细胞的分离培养及鉴定 ..................22
3.2 供体细胞生长曲线的绘制 .................... 24
4 讨论 ......................... 24
实验二 牛卵母细胞体外成熟培养体系的优化 .................26
1.材料 ............................26
1.1 试验药品 ..........................25
1.2 仪器设备 ..........................25
1.3 试验材料..........................27
1.4 试验所用的溶液 ....................27
1.5 检卵管的制作 ........................28
2 试验方法 ....................... 28
2.1 卵巢的采取、运输 ..................... 28
2.2卵丘—卵母细胞复合体的采集 ................28
2.3卵母细胞的选择....................28
2.4卵母细胞体外成熟培养...................29
2.5卵母细胞的外成熟情况的观察..................29
2.6 试验设计.......................29
2.7 统计分析.......................... 29
3.试验结果与分析 ....................... 29
3.1 采卵方法及培养液对卵母细胞体外成熟的影响 ............ 29
3.2 试验照片.......................... 31
4 讨论 ......................... 32
4.1 不同取卵方法对卵母细胞获取及成熟的影响 ................ 32
4.2 不同培养液对卵母细胞体外成熟的影响 .................. 32
试验三：不同的供体核对牛核移植重构胎体外发育的影响 .......... 34
1 材料 .......................... 34
1.1 主要试剂 .......................... 34
1.2 仪器设备 .......................... 35
1.3 溶液配置 .......................... 36
1.4 显微工具的制作......................36
1.4.1 固定针的制作 .......................36
1.4.2 去核针的制作 ..................... 37
1.5 卵巢及核移植供体细胞的来源 .................. 37
2 方法 ......................... 37
2.1 卵母细胞的体外成熟和供体细胞的准备..............37
2.2 卵母细胞的去核以及核移植 .................37
2.3 核移植胚胎的激活以及体外培养....................38
2.4 胚胎染色及囊胚细胞计数 ....................38
2.5 胚胎移植及妊娠检测 ......................38
2.6 试验设计 ..........................39
3 试验结果与分析 .................... 39
3.1 三种供体细胞核移植效果比较.................. 39
3.2 HOECHST33342 染色 .....................42
3.3 探讨不同供体细胞对牛核移植重构胚移植后妊娠率的影响.......... 42
4 讨论 .........................43
结 论 ........................... 45
参考文献........................... 46
致谢........................... 52