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  • 适用专业:动物遗传育种与繁殖
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资料简介

硕士论文-牛胚胎干细胞分离培养及鉴定,共78页,46915字
摘 要
目的:
建立牛胚胎干细胞的获取、分离、培养体系,摸索牛 ESCs 的培养条件。为
核移植的优选供体细胞,用于提高牛的克隆和牛乳腺生物反应器研究的效率。
方法:
本试验分为两部分:一,饲养层的制备。饲养层包括牛骨髓充质干细胞饲养
层、牛乳腺干细胞饲养层和牛成纤维细胞饲养层。牛 MSCs 饲养层的制备采用:
从屠宰场得到新鲜牛股骨,用注射器抽取骨髓间充质干细胞,过滤离心,培养传
代,取第 3 代生长旺盛的牛 MSCs,采用丝裂霉素 C 处理,然后用磷酸缓冲液清
洗后用做饲养层。牛 MaSCs 饲养层的制备采用:从屠宰场得到新鲜荷斯坦奶牛
乳腺,酒精消毒,PBS 清洗,剪成小块,消化离心,接种培养,传代,取第 3
代牛 MaSCs 用做饲养层。牛 SFCs 饲养层的制备采用:组织块培养法培养黑牛
上皮组织和肉牛肌肉组织,采用第 3 代的牛 SFCs 做饲养层。二,牛胚胎干细胞
的获得分离培养及鉴定。牛胚胎干细胞的获得采用:选取健壮、发情周期正常、
2-3 胎母牛做实验牛,待发情后用 FSH 减量注射法激素处理母牛,人工授精,冲
胚得到胚胎,将胚胎移至制备好的饲养层培养皿中孵化培养,囊胚 ICM 细胞数
量增殖 4-6 d 后,得到生长集中、隆起明显的 ICM 集落,即牛胚胎干细胞。牛胚
胎干细胞分离培养及鉴定:在体视镜下,用自制的口吸管连接玻璃微针小心挑起
ICM,使之与饲养层以及滋养层细胞分离,对牛胚胎干细胞进行传代培养,并进
行形态学、染色、核型分析等鉴定。
在试验中选用了三种不同的细胞(牛骨髓间充质干细胞、牛成纤维细胞、牛
乳腺干细胞)作饲养层来进行分离培养牛 ES 细胞,比较了其培养效果。选取三
种胰酶+EDTA 组合(0.25%胰酶-0.04%EDTA、0.20%胰酶-0.04%EDTA 和 0.02%
胰酶-0.04%EDTA)消化处理牛 ES 细胞,比较其消化效果。对胚胎进行冷冻解
冻三种不同处理(鲜胚、冻存解冻 1 次、冻存解冻 2 次),观察牛 ESCs 生长状况。
结果:
1. 证明牛 ESCs 和饲养层有着很大的关系,用牛 MSCs 做饲养层培养的牛
ESCs 要比用牛 MaSCs 和 FSCs 做饲养层试验研究效果好;
2. 用较低浓度的消化液(0.02%胰酶-0.04%EDTA)消化得到的 ESCs 克隆率
最高,所传代数最高,效果较好;
3. 冷冻与解冻处理不会对牛 ESCs 产生损害性的影响,牛 ESCs 具有一定的
抗外界环境的能力。
4. 相近的集落,通过相互吸引,具有自发形成典型的 ES 集落的能力。
5. 通过形态学观察,核型分析,及 AKP 染色鉴定符合牛 ESCs 特征。
关键词:饲养层;牛 ES 细胞;分离培养;传代;鉴定

目录
中文摘要...……………….……. ….1
英文摘要...……………….…….…...3
缩略符号...………………..………….5
文献综述......……...1
1 综述前言...…………………..………1
2 干细胞及研究进展...……..………...2
3 饲养层细胞.…………………..………………....….…...7
4 牛胚胎干细胞....9
5 牛胚胎干细胞获取来源...………....11
6 牛胚胎干细胞生物学特性及鉴定方法..………………15
7 影响牛胚胎干细胞建系的因素......18
8 牛胚胎干细胞建系中存在的问题及解决办法..……...20
9 ES 细胞的应用前景及研究前沿......21
第一部分 饲养层的制备...…….……24
1 试验材料...………………….……..24
1.1 试验动物...………………….……24
1.2 主要试剂及仪器...……….………24
1.3 溶液配置方法...…………….……24
2 试验方法.....…...24
2.1 bBMSCs 饲养层的制备方法..…….……….………...24
2.1.1 牛 MSCs 的分离培养..………….…….…………….24
2.1.2 bBMSCs 的鉴定..…………………..………………25
2.1.3 生长曲线的绘制.....…….……...25
2.1.4 bBMSCs 的冷冻及解冻……………...……..………...26
2.1.5 bBMSCs 饲养层的制备……………...……………...26
2.2 奶牛 MaSCs 饲养层的制备方法..….………………. .26
2.2.1 奶牛 MaSCs 的分离培养.………………….………………..……….........26
2.2.2 奶牛 MaSCs 的鉴定..…………………..…………....28
2.2.3 生长曲线的绘制..………………….28
2.2.4 奶牛 MaSCs 的冷冻及解冻..……..28
2.2.5 奶牛 MaSCs 饲养层的制备.……………...28
2.3 牛成纤维细胞饲养层的制备方法……………..…..…………...28
2.3.1 牛成纤维细胞的分离培养..……….28
2.3.2 牛成纤维细胞的鉴定..……….…….29
2.3.3 生长曲线的绘制..………………….29
2.3.4 牛成纤维细胞的冷冻解冻..……….29
2.2.5 牛成纤维细胞饲养层的制备..….…. 29
3 结果与分析...….…...29
3.1 bBMSCs 饲养层的制备结果.…………….…………………....… 29
3.1.1 bBMSCs 的分离和原代培养..……..………29
3.1.2 bBMSCs 的传代培养..……..………30
3.1.3 bBMSCs 的鉴定..…………………..….30
3.1.4 冷冻解冻对 bBMSCs 的影响..…….…32
3.2 奶牛 MaSCs 饲养层的制备结果..…… 32
3.2.1 奶牛 MaSCs 的分离和原代培养..….32
3.2.2 奶牛 MaSCs 的传代培养..…………..32
3.2.3 奶牛 MaSCs 的鉴定..………………….33
3.2.4 奶牛 MaSCs 生长曲线的绘制..……….34
3.2.5 冷冻解冻对牛 MaSCs 的影响..……….34
3.3 牛成纤维细胞饲养层的制备结果..…….34
3.3.1 牛成纤维细胞的分离和原代培养..…….…….34
3.3.2 牛成纤维细胞的传代培养..………….35
3.3.3 牛成纤维细胞的鉴定..……………….35
3.3.4 冷冻解冻对牛成纤维细胞的影响..….35
第二部分 牛 ES 细胞的获取分离培养及鉴定.………….…………….37
1 材料...……..…………...37
1.1 试验动物..………………..………………37
1.2 主要试剂及仪器.....……….…………….37
1.2.1 检胚管的制作.………………….…………………..…….…….37
1.2.2 消化管的制作..………..…….…….37
1.3 溶液配置方法..………..…..….….......37
2 试验方法..………………..……….…….37
2.1 牛胚胎的获取与 ESCs 的分离培养.………………….…………37
2.1.1 牛的超数排卵....37
2.1.2 牛胚胎干细胞的获取与培养..…….39
2.1.3 牛胚胎干细胞的传代....……………40
2.2 ES 细胞的鉴定...…40
2.2.1 形态观察...……..41
2.2.2 碱性磷酸酶(AKP)染色..……….41
2.2.3 染色体核型分析.…………… .…….41
3 结果与分析.…………………...……….41
3.1 牛胚胎的获取..……….……….……...41
3.2 ICM 的获取....……41
3.3 ESCs 的分离培养鉴定...………...……42
3.3.1 ESCs 的形态学观察.…..……….…..42
3.3.2 ESCs 的 AKP 染色鉴定...………….43
3.4 ES 细胞自发形成典型集落...….…….43
3.5 不同饲养层对牛 ESCs 培养的影响.……………….….…………43
3.6 消化液浓度对牛 ESCs 的影响.……………...44
3.7 不同冷冻解冻对牛 ESCs 培养的影响.……....45
4 讨论...…..….……….46
结论..……………..……………….……….48
参考文献...…….49
附录...………….53
致谢.....……..………….62

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