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硕士论文-小鼠MSCs的分离培养与体外多潜能分化的研究，共84页，42897字
摘
要
骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）起源于中胚层，主要存在于成
年哺乳动物的骨髓中，与造血干细胞（Hemopoietic stem cells, HSCs）共存。MSCs 不仅
参与构建造血微环境，发挥支持造血的作用，而且研究表明其易于体外分离培养和扩增、
可自体移植并具有跨胚层分化为多种细胞表型的能力，例如可以分化为成骨细胞、软骨
细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、成肌细胞和神经细胞等多种细胞，未分化的或经遗传修饰
过的 MSCs 有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的理想种子细胞。本研究目的在于阐
明小鼠骨髓 MSCs 的生物学性能及其分化潜能，优化小鼠 MSCs 的增殖培养条件，以便
未来利用该类细胞作为疾病细胞/基因治疗的模型。为此，本试验利用成年昆明小鼠为对
象，较为系统全面地研究了其 MSCs 的分离、培养、扩增、形态学、生长特性、以及体
外诱导分化能力，为进一步深入研究 MSCs 的诱导分化和应用打下实验基础。结果如下：
1. 本试验应用贴壁分离法成功分离得到昆明小鼠股骨和胫骨 MSCs，体外培养到第
8 代，细胞数量扩增了 5000 倍以上。本试验所分离的昆明小鼠 MSCs 具有该类细胞的典
型特征：外形呈多角形、三角形或长梭形，细胞核质比大、胞浆中细胞器少、核仁明显，
具有快速增殖的能力，类似于人和其它动物的 MSCs，细胞形态均一，排列有序，体外
培养 8 代以上无变化。
2. 小鼠 MSCs 可以在体外用马血清或地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、
吲哚美辛定向诱导分化为脂肪细胞，细胞内有脂滴出现，随着时间延长，脂滴逐渐增加
并融合为脂泡，细胞由梭形转变为圆形或多角形，油红 O 染色呈阳性，从而建立了 MSCs
分化为脂肪细胞的模型，有助于研究肥胖发生的机制。同时，这也是和骨髓造血干细胞
的区别之一。
3. 本试验成功诱导小鼠 MSCs 体外分化为成骨细胞表型，产生 Von Kossa 染色阳性
的矿化结节。试验证明，地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸是诱导 MSCs 向成骨分化
的重要因素，MSCs 可以作为骨组织工程重要的种子细胞来源。
4. 本试验分离获得了小鼠脑神经细胞，细胞形态典型，并成功用于 MSCs 成神经
诱导后的免疫荧光细胞化学鉴定的阳性对照。该分离培养方法简单，可以满足一般实验
的需要。
5. 本试验结果表明，小鼠 MSCs 在 β-巯基乙醇和全反式维甲酸诱导下分化为神经
样细胞，呈现神经细胞的基本形态结构，表达神经细胞的分子标记 NSE 和 NF-200，诱
导产生的神经细胞在神经培养基中培养可以存活，但这种分化细胞是否具有神经细胞的
功能有待于进一步研究。
综上所述，本试验成功分离获得了具有体外多向分化能力的小鼠 MSCs。根据细胞
形态、体外分化能力，可以判定来自于骨髓的细胞为间充质干细胞。结果显示，MSCs
具有巨大的潜在应用前景。但是，彻底阐明 MSCs 的全部生物学性能，并应用于临床实
践还有许多工作要做。
关键词：昆明小鼠
骨髓间充质干细胞（MSCs）
分离培养
多潜能分化
目录
中文摘要 ...... ⅰ
英文摘要 ...... ⅲ
缩略符号 ...... ⅵ
文献综述.......... 1
1综述前言.... 1
2MSCs 的生物学特性和表型特征 .... 2
2.1 MSCs 的生物学特性 2
2.2 MSCs 表达的特异性抗原及细胞因子. 4
3MSCs 的多分化潜能 ........... 5
4MSCs 的分离纯化和培养扩增 ... 9
4.1 MSCs 的分离纯化 .... 9
4.2 MSCs 的培养扩增 .. 10
5MSCs 的鉴定....... 11
5.1 形态学 .... 11
5.2 MSCs 的表面标志物 ........... 11
5.3 分化潜能 12
5.4 免疫细胞化学技术. 12
5.5 流式细胞技术........ 12
6MSCs 的在器官组织创伤修复中的作用 ....... 12
7MSCs 的研究及应用前景 .... 14
研究内容........ 16
1 小鼠 MSCs 的分离培养及生物学特性的研究.......... 16
1 试验材料和方法... 16
1.1 试验材料.. 16
1.1.1 试验动物............ 16
1.1.2 主要试剂、溶液及仪器 . 16
1.2 试验方法.. 17
1.2.1 小鼠 MSCs 分离及原代培养 ...... 17
1.2.2 小鼠 MSCs 的传代培养扩增 ...... 17
1.3 小鼠 MSCs 形态学观察 .... 17
1.3.1 小鼠 MSCs 的瑞氏-姬姆萨（RS-GMS）染色 .... 17
1.3.2 小鼠 MSCs 的碱性磷酸酶（ AKP）染色 ............ 17
1.4 小鼠 MSCs 生长曲线测定 18
2 结果与分析........... 18
2.1.1 小鼠 MSCs 的分离和原代培养 .. 18
2.1.2 小鼠 MSCs 的传代培养扩增 ...... 18
2.3 小鼠 MSCs 形态学观察 .... 19
2.3.1 小鼠 MSCs 的瑞氏-姬姆萨（RS-GMS）染色 .... 19
2.3.2 小鼠 MSCs 的碱性磷酸酶（ AKP）染色 ............ 19
2.4 小鼠 MSCs 生长曲线测定 20
3 讨论.......... 21
2 小鼠 MSCs 体外定向诱导分化为脂肪细胞. 23
1 材料和方法........... 23
1.1 试验材料.. 23
1.1.1 试验动物............ 23
1.1.2 主要试剂、溶液及仪器 . 23
1.2 试验方法.. 23
1.2.1 小鼠 MSCs 分离培养及扩增 ...... 23
1.2.2 小鼠 MSCs 定向诱导分化为脂肪细胞 ... 23
2 结果.......... 24
2.1 小鼠 MSCs 向脂肪细胞诱导分化后的形态学 ....... 24
2.2 小鼠 MSCs 成脂肪细胞诱导分化后的油红 O 染色检测.... 25
3 讨论.......... 27
3 小鼠 MSCs 体外定向诱导分化为成骨细胞. 29
1 材料和方法........... 29
1.1 试验材料.. 29
1.1.1 试验动物............ 29
1.1.2 一般试剂、溶液及仪器 . 29
1.2 试验方法.. 29
1.2.1 小鼠 MSCs 分离培养及扩增 ...... 29
1.2.2 小鼠 MSCs 向成骨细胞诱导 ...... 29
2 结果.......... 30
2.1 小鼠骨髓 MSCs 向成骨细胞诱导后的形态学观察 30
2.2 小鼠骨髓 MSCs 向成骨细胞诱导后的 Von Kassa 染色...... 30
3 讨论.......... 30
4 小鼠原代脑神经细胞的分离培养.... 34
1 试验材料和方法... 34
1.1 试验材料.. 34
1.1.1 试验动物............ 34
1.1.2 主要试剂、溶液及仪器 . 34
1.2 试验方法（小鼠 MSCs 分离及原代培养） ........ 34
2 结果（小鼠原代脑细胞的分离培养） ...... 34
3 讨论.......... 36
5 小鼠 MSCs 体外定向诱导分化为神经样细胞.......... 37
1 材料和方法........... 37
1.1 试验材料.. 37
1.1.1 试验动物............ 37
1.1.2 一般试剂、溶液及仪器 . 37
1.1.3 免疫荧光细胞化学抗体. 37
1.2 试验方法.. 38
1.2.1 小鼠 MSCs 分离培养及扩增 ...... 38
1.2.2 小鼠 MSCs 定向诱导分化为神经样细胞 ............ 38
2 结果与分析........... 39
2.1 小鼠 MSCs 向神经细胞诱导分化后细胞的形态 ... 39
2.2 小鼠 MSCs 向神经细胞诱导分化后的免疫荧光细胞化学染色...... 40
3 讨论.......... 44
结论........ 48
参考文献........ 49
附录 ....... 57
致谢 ....... 63
攻读硕士期间发表的学术论文 .. 64