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硕士论文-奶牛乳腺干细胞的体外分离培养及鉴定研究，共62页，34860字
摘 要
目的：
体外分离培养奶牛 MaSCs，研究其生物学特性，并对其进行体外扩增和鉴定，开辟
奶牛乳腺疾病治疗的新途径，为乳腺生物反应器的制备提供种子细胞。
方法：
本试验分为三个部分：试验一分离 MaSCs，并进行原代和传代培养纯化，绘制其生
长曲线和瑞氏-吉姆萨（RS-GMS）染色来研究其生物学习性，并对细胞进行冻存和复苏。
试验二取 6 月龄和 18 月龄奶牛乳腺组织分离培养 MaSCs，比较其生长特点及增殖能力。
试验三对分离培养并传代纯化的 MaSCs 通过碱性磷酸酶（AKP）染色、染色体核型分
析和 αs1-酪蛋白基因和 k-酪蛋白基因的 PCR 扩增来进行鉴定。
结果：
1．本试验应用贴壁筛选法成功分离得到奶牛 MaSCs，体外培养到第 12 代，细胞数
量扩增到 5000 倍以上。本试验分离得到的奶牛 MaSCs 具有干细胞的典型特征：外形呈
多角形、长梭形或椭圆形，细胞核质比较大、胞浆中细胞器少、核仁明显。奶牛 MaSCs
具有快速增殖能力，细胞形态均一，排列有序，体外培养 12 代细胞活性仍无变化。
2. 6 月龄组牛 MaSCs 增殖能力、贴壁能力、培养形成的细胞集落数均高于 18 月龄
组。
3．瑞氏-吉姆萨（RS-GMS）染色证明奶牛 MaSCs 各代之间形态较一致，绝大多数
细胞为典型的成纤维样，细胞呈漩涡状排列，细胞形态以梭形为主，有少量小圆形细胞
和大而扁的细胞。
4. 碱性磷酸酶（AKP）染色细胞呈阳性，证明所得细胞为比较原始的细胞。
5. 奶牛 MaSCs 核型分析表明该细胞具有正常核型，该细胞状态稳定，体外培养条
件下没有发生恶化。
6. 奶牛 MaSCs αs1-酪蛋白扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条长 1736bp
的片段，k-酪蛋白基因酪蛋白基因扩增出一条长度为 780bp 的目的条带，扩增片段特异
性良好，无杂带出现，目的片段的大小与预期结果相吻合。
综上所述，本试验分离得到的奶牛 MaSCs 的确为比较原始的细胞，根据形态特征、
增殖能力、及鉴定试验基本证明该细胞为奶牛 MaSCs。
关键词：奶牛；乳腺；干细胞；增殖；鉴定
目 录
中文摘要. ⅰ
英文摘要. ⅲ
缩略符号. ⅴ
文献综述... 1
1 综述前言....... 1
2 干细胞及研究进展. 2
2.1 干细胞 2
2.2 胚胎干细胞.. 3
2.3 成体干细胞.. 5
3 乳腺细胞的研究进展......... 8
4 乳腺干细胞的研究现状及进展 ... 9
4.1 乳腺细胞的类型和干细胞的鉴定 ...... 9
4.2 乳腺干细胞的分离........ 10
4.3 乳腺干细胞的培养........ 11
4.4 乳腺干细胞的永生化问题...... 12
4.5 乳腺干细胞和肿瘤干细胞...... 12
4.6 乳腺干细胞与乳腺再生的关系 ........ 12
4.7 乳腺干细胞的研究与乳腺生物反应器 ...... 14
5 总结与展望... 16
研究内容 ....... 17
1 奶牛 MaSCs 的分离培养及生物学特性的研究 .. 17
1.1 试验材料和方法.. 17
1.2 试验方法.. 18
1.3 结果与分析........ 20
1.4 讨论 22
2 不同月龄奶牛 MaSCs 的生物学特性比较 26
2.1 试验材料和方法 26
2.2 试验方法.... 27
2.3 结果与分析 28
2.4 讨论.. 31
3 奶牛 MaSCs 的鉴定试验 ........ 34
3.1 试验材料和方法 34
3.2 试验方法.... 35
3.3 试验结果.... 36
3.4 讨论.. 39
结论... 41
参考文献. 42
附录... 46
致谢... 49