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硕士论文-小鼠睾丸特异性hsp70基因原核表达及mRNA分析的研究，共73页，35455字
摘 要
Hsp70-2 和 Hsc70t 是小鼠睾丸特异性表达的两种热休克蛋白 70 家族成员，它们均
在精子发生的减数分裂期表达。为进一步研究其功能，本研究根据 Genbank 中小鼠的
hsp70-2 和 hsc70t 的 cDNA 序列设计了特异性引物，以由睾丸中提取的总 DNA 为模板，
采用 PCR 方法克隆其基因序列，利用 DNAStar 等软件对其进行序列和抗原表位分析；
利用内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ酶切 hsp70-2 基因，将切下的目的片段插入 pET-32a(+)载体，
构建 pET-32a(+)/hsp70-2 重组质粒。重组质粒经 PCR 和酶切鉴定为阳性后，转化宿主菌
E.coli BL21。利用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳的诱导条件。通过 SDS-PAGE 电泳和
Western blot 对重组蛋白进行分析和鉴定，并利用亲和层析提纯蛋白。以昆明雄性小鼠
为受试动物，分别用近似阴囊温度（33℃）、腹温（37℃）和超高温（42℃）三个温度
组，应激处理 4 h，然后提取睾丸总 RNA，以 18S rRNA 引物作为内标，用半定量 RT-PCR
检测热应激小鼠睾丸内这两种基因的 mRNA 的表达水平。试验结果如下：
1. 用 PCR 方法成功克隆了 1902 bp 的小鼠睾丸 hsp70-2 开放阅读框（GenBank 登录
号为 FJ434401），经 BLAST 分析，与 GenBank 已发表的序列同源性为 99.6%，共有 7
个位点发生突变，氨基酸序列同源性为 99.2%，蛋白抗原表位预测结果显示，该蛋白 72～
113(aa)、 222～ 292、 494～ 541、 556～ 605 区域存在优势抗原表位的可能性最大。
SDS-PAGE 电泳显示，原核表达产物分子质量约为 90 kD，与预计大小相符，对表达重
组蛋白进行可溶性分析，证实该蛋白仅以包涵体形式存在。最佳诱导条件为：0.15 mmol/L
IPTG，30℃，6 h；经 Western blot 试验进一步证实，该重组蛋白具有小鼠 Hsp70-2 反应
原性。
2. 用 PCR 方法成功克隆了 1926 bp 的小鼠睾丸 hsc70t 开放阅读框（GenBank 登录
号为 EU549780），经 BLAST 分析，与 GenBank 已发表序列同源性为 99.9%，共有 2 个
位点发生突变，氨基酸序列同源性为 99.9%，蛋白抗原表位预测结果显示，该蛋白 30～
42(aa)、154～165、245～370、494～605 区域存在优势抗原表位的可能性最大。
3. 用 18S rRNA 做内标对小鼠热应激睾丸内两种基因 mRNA 的表达进行半定量分
析显示：随着热应激温度的升高，小鼠睾丸 hsp70-2 mRNA 相对转录水平逐渐下降，且
各热应激组均显著（P<0.05）低于对照组；随着热应激温度的升高，小鼠睾丸 hsc70t mRNA
相对转录水平逐渐升高，且各热应激组均显著（P<0.05）高于对照组，42℃组 hsc70t mRNA
相对转录水平达到对照组的 1.42 倍。
关键词：小鼠睾丸；Hsp70-2；Hsc70t；RT-PCR；原核表达
目 录
摘 要...........1
ABSTRACT ....................3
英文缩略词表.................. I
文献综述.....1
1 前言.........1
2 Hsp70 与雄性生殖 .......1
2.1 Hsp70 概述 ................1
2.2 Hsp70 对雄性生殖的影响 .............4
3 热应激对睾丸的影响..6
4 大肠杆菌表达系统......6
4.1 大肠杆菌融合表达载体................6
4.2 Lac表达系统..............7
4.3 外源基因在大肠杆菌中的表达....7
4.4 大肠杆菌表达系统的特点............8
试验一 小鼠睾丸hsp70-2 基因的克隆与原核表达9
1 试验材料.9
1.1 试验动物...................9
1.2 主要试剂...................9
1.3 主要仪器设备...........9
1.4 菌株和载体.............10
2 试验方法....................10
2.1 引物的设计与合成.10
2.2 小鼠睾丸hsp70-2 基因的扩增与回收.............10
2.3 小鼠睾丸hsp70-2 基因原核表达载体的构建与鉴定.......... 11
2.4 序列测定与分析.....14
2.5 hsp70-2 基因在E.coli BL21 中的表达及表达条件的优化..15
2.6 重组蛋白免疫印迹分析（Western blot） .....16
2.7 表达的融合蛋白的纯化..............17
3 试验结果....................18
3.1 PCR扩增结果..........18
3.2 小鼠睾丸hsp70-2 基因原核表达载体的鉴定结果..............19
3.3 测序结果分析.........19
3.4 hsp70-2 基因在E.coli BL21 中的表达及表达条件的优化..21
4 讨论.......25
试验二 小鼠睾丸hsc70t基因的克隆与序列分析 .27
1 试验材料....................27
2 试验方法....................27
2.1 引物的设计与合成.27
2.2 小鼠睾丸hsc70t基因的序列的扩增 ................27
2.3 阳性重组质粒的克隆和鉴定......28
2.4 分子进化分析.........28
2.5 抗原表位的预测.....28
2.6 跨膜区的预测.........28
3 试验结果....................28
3.1 目的基因的扩增.....28
3.2 单菌落PCR结果.....29
3.3 质粒PCR鉴定.........29
3.4 测序结果.................30
3.5 同源性比较及亲缘进化树分析..30
3.6 抗原表位的预测.....31
3.7 跨膜区的预测.........32
4 讨论.......33
试验三 热应激对小鼠睾丸特异性hsp70 基因mRNA转录水平的影响 .......34
1 试验材料....................34
1.1 试验动物.................34
1.2 主要试剂与仪器.....34
2 试验方法....................34
2.1 小鼠总RNA的提取 34
2.2 RT-PCR检测 ...........35
2.3 hsp70-2 和hsc70t基因片段的克隆与序列分析....................36
2.4 灰度扫描与数据分析..................36
3 试验结果....................37
3.1 hsp70-2 和hsc70t RT-PCR扩增结果 ...............37
3.2 hsp70-2 和hsc70t基因片段克隆的鉴定结果...37
3.3 测序结果.................37
3.4 热应激小鼠睾丸组织特异性hsp70 mRNA转录的半定量分析 ..............38
4 讨论.......39
结 论.........41
参考文献...42
致 谢.........47
附 录.........48
攻读硕士学位期间发表的学术论文.58