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硕士论文-小鼠卵母细胞印迹基因DNA甲基化研究，共48页，25949字
摘 要
哺乳动物卵巢卵母细胞发育的研究，最初主要关注生殖细胞形成的早期阶段或出生
后卵泡的生长发育。而原始卵泡的体外形成与发育激活方面，虽然有小鼠原始卵泡体外
培养发育并可获得成熟的卵母细胞的报道，但减数分裂前的雌性生殖细胞不能在体外完
成这一卵母细胞发生与成熟的整个发育过程，其原因至今不甚清楚。鉴于此，本研究使
用了本实验室建立的减数分裂前的生殖细胞体外发育的培养体系，将 12.5 dpc 雌性胎鼠
生殖嵴中的减数分裂前的生殖细胞体外培养 28 天以后获得 GV 期的卵母细胞，并通过
亚硫酸盐测序法检测了这些卵母细胞在体外培养过程中的 DNA 甲基化进程，探讨卵母
细胞印迹基因 DNA 甲基化与卵母细胞体外发育阻滞的关系。
本研究首先是对 12.5 dpc 胎鼠生殖嵴进行了体外培养，培养到 7 d 时，出现圆形生
殖细胞；14 d 时,出现典型的初级卵泡结构；21 d 时，卵母细胞直径可达 60 μm，由颗粒
细胞包裹，由于卵泡膜细胞的出现，此时已经形成了明显的卵泡结构，但颗粒细胞增殖
缓慢，只有 2-3 层，并且没有卵泡腔的出现；27 d 时，卵母细胞直径最大可达 70 μm 以
上；28 d 时，一些卵母细胞能够自发的从体外培养的组织中游离出来，并且具有明显的
透明带和生发泡结构。其卵母细胞发育的各个时期，卵母细胞印迹基因 Igf2r（Peg3）
甲基化比例分别为 6.3%、12%、9.3%和 42.67%（3.3%、5.6%、4.4%和 21.67%）；对照
组卵母细胞分别来自于体内 0、7、14 和 21 dpp 的新生鼠卵巢，其甲基化比例分别为 5.6%、
52.7%、80.1%和 95.33%（2.2%、33.3%、76.7%和 88.98%）。由上述可见，印迹基因 Igf2r
和 Peg3 甲基化印迹的建立在卵母细胞体内生长和体外培养过程中存在一定差异。
为了进一步了解 12.5 dpc 胎鼠生殖嵴体外培养获得的卵母细胞印迹基因甲基化模式
的建立过程，本研究分析了卵母细胞直径与印迹基因 DNA 甲基化的关系。将体外培养
28 d 获得的卵母细胞分成 30-45 μm、45-60 μm 和 60-75 μm 三组，其印迹基因 Igf2r 和
Peg3 的甲基化比例分别为 17.33%、33.33%和 94.44%（11.1%、26.11%和 45%），这表明
在体外随着卵母细胞直径的不断增加，Igf2r 和 Peg3 基因的 DNA 甲基化比例不断提高。
相关性分析表明，卵母细胞甲基化进程与直径之间存在强正相关。另外，在相同直径下，
体外培养卵母细胞印迹基因 DNA 甲基化进程要慢于体内发育。
本研究中还检测了颗粒细胞增殖和分化前后，即初级卵泡向次级卵泡转变过程、卵
泡腔形成过程对卵母细胞印迹基因甲基化状况的影响。颗粒细胞增殖前后卵母细胞 Igf2r
和(Peg3)甲基化比例分别为 58.67%和 61.25%（40.56% 和 42.22%）;分化前后分别为
86.67%和 89.67%（86.67%和 88%）。由上述可见，颗粒细胞的增殖与分化对直径大致相
同的卵母细胞印迹基因甲基化没有影响。
关键词：小鼠; 卵母细胞; 体外培养；印迹基因; 甲基化
目录
摘 要..... 1
Abstract 1
前 言..... 1
第一部分
文献综述. 2
1 雌性动物生殖细胞印迹基因 DNA 甲基化研究进展 . 2
1.1 DNA 甲基化及其生物学意义 ... 2
1.2 基因组印迹基因及其生物学意义 ....... 3
1.3 配子及胚胎发生过程中甲基化印迹的动态学和时序 ........ 4
2 哺乳动物卵母细胞体外发生研究进展 .. 5
2.1 原始卵泡的形成与发育的启动 5
2.2 哺乳动物卵泡体外发生的研究进展 ... 6
第二部分
试验研究. 8
1 材料与方法.. 8
1.1 试验材料... 8
1.1.1 试验动物 8
1.1.2 试验试剂 8
1.1.3 试验仪器 9
1.2 试验方法... 9
1.2.1 胎鼠生殖嵴的分离....... 9
1.2.2 胎鼠生殖嵴的体外培养....... 10
1.2.3 卵母细胞的收集........ 10
1.2.4 卵泡的收集..... 10
1.2.5 卵母细胞 DNA 的提取 ........ 10
1.2.6 亚硫酸盐测序. 11
1.2.7 卵母细胞 RNA 的提取及 cDNA 的合成.. 14
1.2.8 定量 PCR........ 15
1.2.9 统计方法......... 16
2 结果与分析 16
2.1 12.5 dpc 胎鼠生殖嵴卵母细胞的体外发育.. 16
2.2 卵母细胞印迹基因 DMR 甲基化进程 ........ 17
2.3 卵母细胞 DNA 甲基化转移酶的表达检测 . 20
2.4 印迹基因甲基化进程与卵母细胞直径的关系 ....... 21
2.5 卵泡颗粒细胞增殖和分化与印迹基因甲基化的关系 ...... 24
3 讨论. 26
3.1 体外分化卵母细胞减数分裂阻滞恢复的影响因素 26
3.2 卵母细胞印迹基因甲基化进程的影响因素 27
结论........ 29
参考文献........ 30
致谢........ 34
个人简介........ 35