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H9N2禽流感病毒对BALBc小鼠S1PR1表达和分布的影响，硕士学位论文，共60页，25824字。
摘要
我国1994年首次分离到H9N2亚型禽流感，随后的研究发现其对禽的危害越来越严重并呈现了对哺乳动物致病性增强的现象，该病毒导致的公共安全问题也引起了广泛的关注。在对H9N2亚型禽流感的研究中，该病毒作为基因储备库及其与宿主细胞相互作用的研究成为了重要的热点问题。SlPR1作为G蛋白偶联受体之一，其介导的生物学效应复杂，并且这种效应在各组织中发挥的功能也不一样。在多种免疫细胞膜上，S1PR1介导多种免疫应答信号通路的激活。S1PR1在禽流感病毒感染情况下功能是否存在多样性？对免疫应答的作用如何？这些问题都亟待解决。
我们以BALB/c小鼠为模型，通过研究H9N2亚型禽流感感染小鼠后S1PR1的表达模式变化趋势，可以推断出S1PR1在流感病毒与宿主反应过程中可能发挥的的作用，也可以揭示流感病毒感染宿主后，宿主机体内的部分相关变化。本研究共分为3个部分：
1. BALB/c小鼠S1PR1基因克隆及序列分析
以BALB/c小鼠肝脏总RNA为模板，运用RT-PCR方法扩增了BALB/c小鼠S1PR1基因完整CDS区，并将其克隆到pMD18-T载体中进行测序，运用分子生物学软件对所获得的序列进行了分析。结果表明，所克隆的BALB/c小鼠S1PR1基因约1483核苷酸，包含BALB/c小鼠S1PR1基因完整CDS区1149个核苷酸。此段序列编码342个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约40kDa。测序结果显示产物与GenBank登录的NM007901.5的小鼠S1PR1基因的mRNA的同源性为99% ，在第565、582 位为发生C→A和A→C的改变。对BALB/c小鼠S1PR1基因提交GenBank，获得的acc.No分别是：JX843822.1。
2. BALB/c小鼠S1PR1基因mRNA在各个组织中的表达测定
以三组小鼠各个组织中总RNA为模板，运用荧光定量PCR方法扩增3组小鼠S1PR1基因和β-actin基因。荧光定量PCR结果显示：从空白对照组、攻弱毒TS组、攻强毒V毒组三组整体来说，除了肺和脑组织内，S1PR1基因表达量普遍趋势是V毒感染组﹥空白对照组﹥TS毒感染组。除了肺和胃，TS毒感染组和V毒感染组与对照组相比差异极显著。
3.BALB/c小鼠S1PR1免疫组织化学分析
本实验按照有限稀释病毒纯化法纯化2株H9N2 亚型禽流感病毒H9N2 influenza A virus A/chicken/Guangdong/TS/2004(TS)和H9N2 influenza A virus A/chicken/ Guangdong/V/2008 (V)，纯化3代后通过尿囊腔途径接种病毒于10日龄SPF 鸡胚，测HA 效价。将纯化的两株病毒分别经鼻腔感染BALB/c小鼠并设空白对照组，记录体重及死亡情况。五天后，处死小鼠取心、肝、脾、肺、肾、脑、胃。利用免疫组织化学技术对S1PR1蛋白在正常及攻毒小鼠各个组织的分布进行研究，结果表明：在S1PR1蛋白在采用流感病毒H9N2不同毒株攻毒后，蛋白在各个组织的检出量和分布发生了一定的变化，这种变化也许与流感病毒H9N2造成的炎症密切相关。
免疫组化和实时荧光定量PCR综合结果可看出除肺脏和脾脏外，其他组织中H9N2亚型禽流感病毒感染后mRNA水平和蛋白水平内部变化一致。H9N2亚型禽流感病毒感染宿主后最主要在肺脏和脾脏大量增殖，但肺脏和脾脏结果却不规律。这可能是由于先天免疫和后天免疫的复杂性导致S1PR1在H9N2亚型禽流感感染后的应答出现的变化不是简单的线性关系。而各组织内S1PR1 mRNA水平和蛋白水平的不一致可能有多种原因，如转录后调控、蛋白翻译的滞后性、蛋白加工过程中活性改变、mRNA在体内降解速度比蛋白质快、mRNA若产生过多会受机体自身一些分子调控，如miRNA。mRNA的水平本就不能准确反映蛋白水平，故各组织内S1PR1 mRNA水平和蛋白水平的不一致的原因只有进行信号通路方面的研究才可具体解释。
我们对于这些问题的探索将对S1PR1在病毒宿主相互作用过程中发挥的作用有更深一步的揭示，也将为人类防治病毒性疾病提供新的思路和契机。
关键词：S1PR1；H9N2；表达模式；免疫组化；实时荧光定量PCR

目 录

1 前言 1
1.1 H9N2禽流感的发现及在我国流行现状 1
1.2 S1PR1概况及其研究意义 2
1.2.1 S1P和S1PR1的发现及其基本功能 2
1.2.2 S1PR1分布及相应介导的信号通路 3
1.3 S1PR1在H9N2亚型禽流感病毒感染中的研究 5
2 材料与方法 6
2.1 材料 6
2.1.1 实验动物 6
2.1.2 毒株、血清、抗体和质粒 6
2.1.3 主要试剂盒及试剂 6
2.1.4 主要溶液的配制 8
2.1.4.1 RNA提取用试剂的配制 8
2.1.4.2 琼脂糖电泳用试剂的配制 8
2.1.4.3 大肠杆菌感受态的制备及转化用溶液的配制 8
2.1.4.4 免疫组化相关溶液的配制 9
2.1.5 主要仪器设备 9
2.1.6 分析工具软件 10
2.2 方法 10
2.2.1 鼠S1PR1基因的克隆与鉴定 10
2.2.1.1 BALB/c小鼠肝脏总RNA的提取 10
2.2.1.2 引物的设计与合成 11
2.2.1.3 cDNA的合成 11
2.2.1.4 PCR扩增BALB/c小鼠S1PR1基因 12
2.2.1.5 PCR产物的回收 13
2.2.1.6 感受态细胞（JM109）的制备（氯化钙法） 13
2.2.1.7 pMD18-T载体的连接反应 14
2.2.1.8 连接产物的转化 14
2.2.1.9 阳性质粒的初步筛选 14
2.2.1.10质粒的提取 15
2.2.1.11 HindIII单酶切鉴定阳性质粒 15
2.2.1.12重组质粒的序列测定及分析 16
2.2.2 H9N2亚型禽流感对BALB/c小鼠S1PR1基因表达模式的影响 16
2.2.2.1 纯化病毒的获得及BALB/c小鼠的预处理 16
2.2.2.2 BALB/c小鼠S1PR1基因荧光定量实验 17
2.2.2.3 BALB/c小鼠S1PR1基因的组织学分布 19
3 结果与分析 20
3.1 BALB/c 小鼠S1PR1基因克隆与序列分析 20
3.1.1 BALB/c 小鼠S1PR1基因的克隆与质粒的鉴定 20
3.1.2 BALB/c 小鼠S1PR1基因的序列分析 21
3.2 两株毒株HA测定及病毒对小鼠致病性结果 21
3.3 BALB/c 小鼠S1PR1基因的荧光定量实验和免疫组化实验 23
3.3.1 BALB/c 小鼠S1PR1基因荧光定量实验结果与分析 23
3.3.1.1 荧光定量实验S1PR1基因和Beta-actin基因的鉴定 23
3.3.1.2荧光定量实验溶解曲线 23
3.3.1.3荧光定量PCR扩增曲线 24
3.3.1.4标准曲线 25
3.3.1.5 S1PR1基因在各个组织的mRNA相对水平的研究 26
3.3.2 BALB/c 小鼠S1PR1基因的免疫组织化学检测 27
4 结论与讨论 36
4.1 结论 36
4.2 讨论 37
4.2.1 H9N2 亚型禽流感病毒对哺乳动物的致病性研究 37
4.2.2 BALB/c 小鼠是理想实验动物模型 38
4.2.3 实时荧光定量PCR技术检测mRNA水平变化 38
4.2.4 免疫组织化学技术对蛋白定性及分布的检测 39
致 谢 41
参 考 文 献 42
附图： 47
附录 A 49
华南农业大学学位论文原创性声明 50
学位论文版权使用授权书 50