学海网

三黄鸡NLRP3基因组织表达和分布的研究，硕士学位论文，正文共66页，25251字，附开题报告、答辩文稿。
摘要
NLRP3炎性复合体作为重要的病原体相关的模式分子（PAMPs）直接参与了炎症的发生和发展。NLRP3炎性复合体主要由核苷酸结合寡聚化结构域受体（NLRP3）、酸溶性胶原蛋白(ASC)、pro-caspase-1蛋白等3部分组成，其中NLRP3作为该炎症小体的核心分子和传感器，对调控炎症小体激活及下游信号转导具有关键性的作用。三黄鸡是华南地区最重要的优质肉鸡品种，在规模化饲养过程中，炎症性疾病的危害日益严重。到目前为止，还没有鸡NLRP3组织特异性表达和分布的数据，这严重妨碍了三黄鸡炎症性疾病发生机制的研究。本研究对三黄鸡NLRP3进行了基因克隆和序列分析，通过重组原核表达纯化蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体，分别通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学技术研究三黄鸡各个组织中NLRP3的mRNA相对表达水平及NLRP3蛋白的组织学分布。研究结果将有助于阐明不同组织中的NLRP3在鸡炎症性疾病中的作用和为进一步探索NLRP3在不同物种的功能和进化提供了基础数据。本研究共分为4部分内容：
1、三黄鸡NLRP3基因克隆及序列分析
运用RT-PCR方法扩增了三黄鸡NLRP3基因，并将其克隆到pMD18-T载体中进行测序，对获得的基因序列提交到GenBank，获得accession no： KF318520。运用分子生物学软件对所获得的序列进行了分析，结果显示，所克隆的三黄鸡NLRP3基因编码734个氨基酸，蛋白分子量为82.7 KDa。通过MegAlign软件对不同物种的NLRP3基因序列和氨基酸序列进行同源性分析，三黄鸡NLRP3基因与牛、羊、猪、狨、人、猕猴、小鼠和大鼠的同源性分别为54.2%、53.9%、53.7%、55.4%、54.3%、54.5%、53.5%、53.7%，该基因哺乳类动物间的同源性高，鸡和哺乳类动物间的同源性低，仅有52%。
2、实时荧光定量分析三黄鸡NLRP3基因的表达
溶解曲线分析确保了PT-PCR扩增的NLRP3和β-actin片段引物的特异性。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在253bp和167bp处有一条相应的特异性条带，其大小与理论推测相符。NLRP3基因在三黄鸡所检测的所有组织中均有表达。NLRP3基因在三黄鸡的肺脏和气管中的表达量大大高于其它组织，而在三黄鸡的心脏，肝脏，脾脏，肾脏，脑和法氏囊中的表达则没有明显的差异。
3、三黄鸡NLRP3原核表达与多抗制备
通过双酶切和序列测定证明成功构建了pET32a (+)-NLRP3表达质粒。NLRP3His标签重组融合蛋白得到有效表达，通过SDS蛋白凝胶电泳检测纯化蛋白条带大小约为100 KDa，与其预测的大小相一致。用His 标签抗体和免疫家兔制备的纯化IgG抗体分别进行Western blot检测，结果表明表达的融合蛋白均为NLRP3His标签重组融合蛋白。
4、免疫组织化学分析三黄鸡NLRP3蛋白分布
利用免疫组织化学技术对NLRP3蛋白在三黄鸡各个组织的分布进行研究。结果表明，三黄鸡NLRP3蛋白在细胞质中表达。NLRP3蛋白在心脏和脾脏呈现弱阳性至中强阳性反应，但是在气管、肺、脑、肝、法氏囊和肾脏中呈现强阳性反应。气管纤毛上皮细胞，基底细胞，固有层和粘膜下层细胞呈强阳性，环状软骨细胞呈阴性。肺泡上皮细胞呈强阳性。心肌细胞呈弱阳性至中强阳性，心肌间结缔组织呈阴性。大脑皮层部分基质呈弱阳性，神经元细胞呈中至强阳性。脾脏内皮网状细胞呈弱阳性至中强阳性，淋巴细胞呈阴性。法氏囊髓质淋巴细胞呈强阳性，皮质细胞呈局灶性强阳性。法氏囊黏膜上皮细胞呈中至强阳性。部分肝细胞呈中至强阳性。大多数肾小管上皮细胞呈中至强阳性，肾小球和肾小球囊细胞呈阴性。
关键词：三黄鸡；NLRP3；表达；组织分布

目 录
1 前言 1
1.1 病毒感染性炎症的发生及其机制 1
1.2 NLRP蛋白家族及其在炎症反应中的作用 2
1.2.1 NLRP蛋白家族 2
1.2.2 NLRP3炎性复合体的组成及其在炎症反应中作用 3
1.3 NLRP3基因的分子结构及其分布情况 5
1.4 NLRP3炎性复合体参与机体炎症的途径及其机制 5
1.5 NLRP3炎性复合体参与流感炎症的途径及其作用 7
1.6 本研究的目的和意义 7
2 材料与方法 8
2.1 材料 8
2.1.1 实验动物 8
2.1.2抗体 8
2.1.3 主要试剂盒及试剂 8
2.1.4 主要溶液的配制 10
2.1.5 主要仪器设备 11
2.1.6 分析工具软件 12
2.2 方法 12
2.2.1 三黄鸡NLRP3基因的克隆与鉴定 12
2.2.2 三黄鸡NLRP3基因荧光定量实验 20
2.2.3 三黄鸡ST3GalIII基因的原核表达与多抗的制备 24
2.2.4 三黄鸡NLRP3基因的组织学分布 28
3 结果与分析 29
3.1 三黄鸡NLRP3基因的克隆与序列分析 29
3.1.1 三黄鸡NLRP3基因的克隆与质粒的鉴定 29
3.1.2 三黄鸡NLRP3基因的序列分析 30
3.2 三黄鸡NLRP3基因荧光定量结果与分析 33
3.2.1 三黄鸡荧光定量实验NLRP3基因和β-actin基因的鉴定 33
3.2.2 荧光定量实验溶解曲线 34
3.2.3 荧光定量PCR扩增曲线 35
3.2.4 标准曲线 36
3.2.5 NLRP3基因在各个组织的相对表达水平 37
3.3 三黄鸡NLRP3基因的原核表达与多抗制备 38
3.3.1 原核表达载体构建结果 38
3.3.2 三黄鸡NLRP3蛋白的诱导表达及纯化 39
3.3.3重组蛋白的纯化 40
3.3.4 三黄鸡NLRP3蛋白多克隆抗体的制备 41
3.4 三黄鸡NLRP3基因的组织学分布 42
4 讨论与结论 47
致 谢 50
参 考 文 献 51
附录 A 56

资料预览图片：