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硕士论文-三黄鸡唾液酸转移酶基因组织学表达和分布的研究，共82页，27484字。
摘 要
唾液酸（sialic acid，SA）是神经氨酸的衍生物，分布于细胞表面。在流感病毒感染机体的细胞时，流感病毒的凝集素（HA）首先与其受体唾液酸结合，介导流感病毒进入细胞并完成在细胞内复制的过程。禽流感病毒倾向识别α-2,3唾液酸受体(NeuAcα-2,3-Gal)，而人流感病毒倾向识别α-2,6唾液酸受体(NeuAcα-2,6-Gal)。唾液酸受体是由磷酸烯醇丙酮酸与N-乙酰甘露糖胺-6磷酸在胞质中缩合成9-磷酸-N-乙酰神经氨酸或与6磷酸甘露糖缩合成9-磷酸去氨基神经氨酸为骨架而来的。在唾液酸生物合成的过程中，唾液酸转移酶（sialyltransferase,ST）是唾液酸形成的限速酶和结构确定的关键酶，它催化α-2,3和α-2,6键的形成。三黄鸡是华南地区最重要的优质肉鸡品种，也是禽流感综合防控压力极大的肉鸡品种之一。为研究流感病毒的侵入起始阶段唾液酸转移酶发挥的作用，我们克隆了三黄鸡的7个唾液酸转移酶（ST），并通过半定量检测了唾液酸转移酶mRNA在各组织的分布情况；通过对ST3GalIII亚型ORF 克隆与原核表达，成功制备了多抗血清，并通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学确定三黄鸡ST3GalIII的mRNA和蛋白的表达水平；同时，在真核293T细胞系细胞中表达了ST3GalIII，为ST3GalIII在疾病的发生与发展过程中的作用提供了基础数据。本研究共分为5部分内容：
1、三黄鸡ST基因的克隆及序列分析
以三黄鸡肝脏总RNA为模板，运用RT-PCR方法扩增了三黄鸡ST的7个亚型基因，并将其克隆到pMD18-T载体中进行测序，运用分子生物学软件对所获得的序列进行了分析。结果表明，所克隆的三黄鸡ST3GalI基因约1085个核苷酸，ORF长1029 bp，编码342个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约40kDa；ST3GalIII基因约1145个核苷酸，ORF长1077 bp，编码358个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约40kDa；ST3GalIV基因约1066个核苷酸，ORF长1008 bp，编码335个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约38kDa；ST3GalV基因约1138个核苷酸，ORF长1107 bp，编码368个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约40kDa；ST3GalVI基因约1169个核苷酸，ORF长990 bp，编码329个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约38kDa；ST6GalI基因约1400个核苷酸，ORF长1242 bp，编码413个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约47kDa；ST6GalII基因约1825个核苷酸，ORF长1590 bp，编码529个氨基酸残基的蛋白，推测其相对分子质量约61kDa。同时将所克隆的ST基因与已报道的人，黑猩猩，牛，猪，小鼠相应序列作比较，发现其核苷酸序列的同源性不高，并通过生物学软件预测了所克隆的ST基因蛋白的特点。对三黄鸡这写获得的基因提交GenBank，获得的acc.No分别是：JX035875(ST3GalI),JX035876(ST3GalIII),JX035870(ST3GalIV),JX035871(ST3GalV),JX035874(ST3GalV),JX035872(ST6GalI),JX035873(ST6GalII)。
2、三黄鸡ST基因表达的半定量和荧光定量分析
以三黄鸡各个组织中总RNA为模板，运用RT-PCR方法扩增了三黄鸡ST基因和β-actin基因，并将其纯化后进行测序。半定量结果显示：ST3GalI基因在心脏中表达量高，在法氏囊中表达量低；ST3GalIII基因在肾脏中表达量高，在法氏囊中表达量低；ST3GalIV基因在法氏囊中表达量高，在肺中表达量低；ST3GalV基因在肺脏中表达量高，在胸腺中表达量低；ST3GalVI基因在肾脏中表达量高，在肺中表达量低；ST6GalI基因在心脏中表达量高，在脑中表达量低；ST6GalII基因在胸腺中表达量高，在肝脏中表达量低。ST3GalIII的荧光定量结果与半定量一致。
3、三黄鸡ST3GalIII的原核表达与多抗的制备
以含有三黄鸡ST3GalIII基因的重组质粒pMD18-T-ST3GalIII为模板，扩增带有BamHI和SalI酶切位点的基因片段，亚克隆至表达载体PET32a(+)，成功构建了原核表达质粒PET32a(+)-ST3GalIII，转化宿主细菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析后，将目的蛋白割胶纯化并以此纯化产物制成油乳剂免疫家兔，制备兔抗鸡ST3GalIII多克隆抗体。双向琼脂糖凝胶扩散和间接ELISA法测得抗体效价较高。Western blot结果表明，抗体有较高的特异性。获得了效价高，特异性好的兔抗ST3GalIII多克隆抗体
4、三黄鸡ST3GalIII蛋白的免疫组织化学分析
利用免疫组织化学技术对ST3GalIII蛋白在三黄鸡各个组织的分布进行了研究，结果表明，ST3GalIII蛋白在三黄鸡的检测组织内除了肾脏，脑，胸腺外均有不同程度表达和分布。ST3GalIII蛋白在肺的气管，支气管，肺泡上皮都有分布；心肌细胞呈现中强阳性表达，然而心肌间质却是阴性；肝细胞为中阳性，肝血管与肝窦内皮细胞为阴性；脾脏，阳性细胞主要分布在脾小体的一些脾细胞和内皮细胞中；法氏囊，阳性细胞主要集中在皮质，而髓质为弱阳性。然而在肾、大脑和胸腺没有检测到ST3GalIII蛋白。
5、PIRES2-EGFP- ST3GalIII真核表达载体的构建及其在293T细胞中的初步表达
含有三黄鸡ST3GalIII基因的重组质粒pMD18-T- ST3GalIII为模板，扩增带有Xho I和Sac II酶切位点的基因片段，经酶切纯化后再将其亚克隆到带有加强型绿色荧光蛋白报告基因的pIRES2-EGFP 真核表达载体中,对重组质粒pIRES2-EGFP-ST3GalIII 进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到293T细胞,荧光显微镜观察其表达情况。结果表明,真核表达载体pIRES2-EGFP-ST3GalIII构建成功并可以在293T细胞中表达。该表达载体可以作为研究ST3GalIII蛋白生理功能的重要工具。
关键词：三黄鸡；唾液酸转移酶；表达；免疫组织化学

目 录
1 前言 1
2 材料与方法 5
2.1 材料 6
2.1.1 实验动物 6
2.1.2 菌株和质粒 6
2.1.3 主要试剂盒及试剂 6
2.1.4 主要溶液的配制 8
2.1.5 主要仪器设备 9
2.1.6 分析工具软件 10
2.2 方法 11
2.2.1 鸡ST基因的克隆 11
2.2.2 三黄鸡ST基因半定量实验 18
2.2.3 三黄鸡ST3GalIII基因荧光定量实验 20
2.2.4 三黄鸡ST3GalIII基因的原核表达与多抗的制备 24
2.2.5 三黄鸡ST3GalIII基因的组织学分布 28
2.2.6 PIRES2-EGFP-ST3GalIII真核表达载体的构建 30
3结果与分析 31
3.1 三黄鸡ST基因的克隆与序列分析 31
3.1.1 三黄鸡ST基因的克隆与质粒的鉴定 31
3.1.2 三黄鸡ST基因的序列分析 32
3.2 三黄鸡ST基因半定量和荧光定量结果与分析 34
3.2.1 三黄鸡ST基因半定量实验结果与分析 34
3.2.2 三黄鸡ST3GalIII基因荧光定量实验结果与分析 39
3.3 三黄鸡ST3GALIII基因的原核表达与多抗制备 43
3.3.1 原核表达载体构建结果 43
3.3.2 三黄鸡ST3GalIII蛋白的诱导表达及纯化 44
3.3.3重组蛋白的纯化 45
3.4三黄鸡ST3GALIII基因的组织学分布 47
3.4.1 ST3GalIII组织学分布结果 47
3.4.2 结果分析 47
3.5 三黄鸡ST3GALIII的真核表达 49
3.5.1 PIRES2-EGFP-ST3GalIII重组质粒的鉴定 49
3.5.2重组表达质粒转染结果 49
3.5.3真核表达的WB验证结果 50
3.5.4 结果与分析 50
4 讨论与结论 50
致 谢 53
附录 A 57
附录 B 58