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硕士论文-表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组鸭瘟病毒的构建，共67页，36500字
摘 要
禽流感(Avian influenza virus )是由禽流感病毒(AIV)引起的一种高度接触性传染病，
几乎所有的野生及家养禽类都可感染，该病经常给养禽业造成严重的经济损失。安全有
效的抗 AIV 疫苗一直是 AIV 研究的重点。活载体疫苗可同时诱导体液免疫反应和细胞
免疫反应，有利于抵抗变异性强的病毒。鸭瘟病毒（DPV）作为一种疱疹病毒，拥有庞
大的基因组和许多非必需区，具有用作表达外源基因的病毒活载体的巨大潜力，被认为
是理想的活疫苗载体。
本研究从感染鸡胚成纤维细胞（CEF）的鸭瘟病毒（DPV）疫苗毒株中提取了总
DNA ，并以此为模板，利用 PCR 技术扩增出病毒生长非必需的 TK 基因（约 2.5kb），
将其克隆入 pUC19 载体获得载体 puDTK。根据已知载体 pcDNA-LacZ 的序列设计了一
对引物，PCR 扩增出 pcDNA-LacZ 上含 CMV 启动子、多克隆位点、SV40 及 LacZ 的完
整的基因表达盒插入 puDTK 的 TK 上，获得质粒 puDTCL。根据 Genbank 已发表的 H5N1
亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列，设计一对特异性引物，利用 RT-PCR 技术扩增
A/chicken/Shandong/wf415/2007 株 H5N1 亚型的禽流感病毒的 HA 基因，把 HA 基因作
为目的片段克隆到 puDTCL 的表达盒的多克隆位点 Nhe I 与 Apa I 之间，成功构建含 LacZ
及 HA 基因的转移载体质粒 puDTCL-HA。将这载体质粒与 DPV34F2 疫苗毒共转染鸡
胚成纤维细胞(CEF)，经蓝斑克隆筛选和纯化，纯化病毒经 PCR 鉴定和 Western－blot 分
析，结果表明：获得了表达 HA 基因的重组鸭瘟病毒 (rDPV-HA)。
本研究初步获得了一株能同时表达禽流感 HA 的重组鸭瘟病毒 rDPV-HA，同时，
构建的转移载体 puDTCL 为开发鸭瘟病毒二价基因工程疫苗提供了条件。为研制抗 AIV
的重组鸭瘟病毒活载体疫苗奠定了基础。重组的 DPV 疫苗在将来进一步的研究中可作
为新型 AIV 基因工程疫苗代替禽流感传统的全病毒灭活苗，为禽流感的防治带来新的
技术。
关键词：禽流感病毒；鸭瘟病毒；TK 基因；HA 基因；重组病毒
目录
摘 要..Ⅰ
ABSTRACT.......Ⅱ
缩略词......Ⅲ
前言 ........1
1 禽流感病毒的概述 .......2
1.1 AIV的病原学及分子生物学..........2
1.2 水禽流感研究进展 ..4
2 禽流感的疫苗研究进展.......5
2.1 灭活全病毒疫苗 ..........5
2.2 亚单位疫苗 ...5
2.3 DNA疫苗 ......6
2.4 重组活载体疫苗..6
2.5 反向遗传操作疫苗 ........6
3 鸭瘟病毒载体研究进展.......7
3.1 鸭瘟病毒概述 ..........7
3.2 鸭瘟病毒基因组特征...8
3.3 鸭瘟疫苗研究进展....... 10
4 本研究的目的和意义..........11
试验一 H5N1 亚型禽流感病毒 HA 基因的克隆及序列分析 ............13
1 材料与方法..13
1.1 材料......13
1.1.1 质粒和菌株.13
1.1.2 SPF鸡胚........13
1.1.3主要试剂与工具酶.............13
1.1.4 主要溶液的配制.........14
1.1.5 主要仪器........14
1.2 方法........14
1.2.1 引物设计与合成.14
1.2.2 鸡胚接种繁殖毒株 . .. .. .. .. .. .. ... 15
1.2.3 病毒RNA的提取 .15
1.2.4 反 转录 ....15
1. 2.5 PCR 扩增 ...... ........ ...... ........1 6
1.2. 6 PCR扩增产物的凝胶电泳......16
1.2.7 目的基因的回收纯化.........16
1.2.8目的基因与载体的连接 ........17
1.2. 9 感受态细胞的制备........17
1.2.10 连接产物的转化...........17
1.2.11 碱裂解法小量制备质粒DNA .....18
1.2.12 重组质粒的鉴定.............18
1.2.13 目的基因序列测定及分析........19
2 结果..........19
2.1 目的基因片段的扩增....20
2.2 重组质粒的PCR鉴定及酶切鉴定.....20
2.3 HA基因序列测定及分析........21
3 讨论...21
试验 二 重组鸭瘟病毒的 构建 .............22
1 材料与方法........23
1.1 材料..............23
1.1.1 毒株和细胞.23
1.1.2 质粒和菌株.23
1.1.3 工具酶 .23
1.1.4 主要溶液的配制.........23
1.1.5 主要仪器....25
1.2 方法.............26
1.2.1 鸭瘟病毒同源臂TK基因的克隆....26
1.2.2 含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒的克隆.27
1.2.3 鸭瘟病毒转移载体质粒的构建.... .........28
1.2.4 鸭瘟病毒转移载体质粒与DPV34F2疫苗株共转染. .........35
1.2.5 重组病毒的筛选与纯化...........36
2 结果......37
2.1 DPV引起的细胞病变......37
2.2 同源臂TK基因及表达盒基因的PCR扩增结果..........37
2.3 重组质粒的 鉴定 ........38
2.4 重组病毒的 筛选 与 纯化 ..........40
2.5 重组鸭瘟病素的初步鉴定 ........40
3 讨论....42
3.1 选用鸭瘟病毒作载体的研究和应用.....42
3.2 报告基因的选择..........42
3.3 关于重组病毒rDPV的构建 .............43
3.4 关于转染的讨论 ......... .. .......43
3.5 报告基因和目的基因的表达........44
3.6 有关鸭瘟病毒的同源重组44
3.7 本研究的创新点..........45
3.8 本研究的应用前景..........45
全文总结.............47
参考文献.............48
致谢.......53