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硕士论文-H9亚型禽流感病毒HA基因重组禽痘病毒的构建，共65页，36004字
中 文 摘 要
禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，高致病性禽流感已被世界动
物卫生组织（OIE）列为急烈性传染病，近些年低致病性禽流感也大范围流行，尤其是
H9亚型禽流感不仅给养禽业带来重大的经济损失，而且开始威胁人类健康。基于该背景，
本研究构建了H9亚型禽流感病毒HA基因重组禽病毒，为进一步防治禽流感打下基础。
根据 Genbank 上发表的 H9 亚型禽流感病毒 HA 基因序列，设计并合成一对特异性引
物，利用 RT-PCR 技术扩增 17 株山东省内不同地区宿主来源的 H9 亚型的禽流感病毒的
HA 基因，将获得的目的基因分别克隆到 pMD18-T simple vector 上，筛选阳性克隆进行
序列分析。结果表明：获得的目的基因片段序列分别与标准株序列相符，可以用于下一
步构建重组鸡痘病毒转移载体的试验。
构建 H9 亚型禽流感病毒 HA 基因禽痘病毒转移载体，经转染、蓝斑克隆、筛选和纯
化，获得了遗传性状稳定的 HA 基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细
胞（CEF）的 DNA 进行 PCR 扩增，获得 1.7kb 的携带有外源目的基因的片段。收集纯化
的重组病毒 CEF 细胞，用 H9 亚型 AIV 多克隆血清作一抗，碱性磷酸酶标记的鸡 IgG 为
二抗进行 Western blot 检测，结果表明重组痘病毒能在体外的 CEF 细胞表达 HA 糖蛋白。
关键词：禽流感病毒；HA 基因；重组禽痘病毒；
目 录
中 文 摘 要 ......1
ABSTRACT .........2
英文缩写词表 .....3
前言 ..4
1 禽流感病毒概述 .5
2 禽流感病毒分子生物学研究进展..........7
3 H9 亚型禽流感流行现状 .....14
4 禽流感疫苗 ....15
5 禽痘病毒载体研究进展......18
试验一 目的基因的克隆及序列分析........23
1 试验材料 ......23
2 试验方法 ......24
2.1 引物设计与合成 .........24
2.2 病毒的分离 ..24
2.3 病毒 RNA 的提取 .........24
2.4 cDNA 的制备 ..25
2.5 PCR 扩增 .....25
2.6 琼脂糖凝胶电泳 .........25
2.7 PCR 扩增产物的回收 ......25
2.8 目的片段与载体的链接....26
2.9 感受态细胞的制备 .......26
2.10 连接产物转化 ..........27
2.11 破裂解法小量提取质粒...27
2.12 重组质粒的鉴定 ........28
3 结果与分析 ....28
3.1 RT-PCR 扩增 ..28
3.2 重组质粒的酶切鉴定......29
3.3 HA 基因序列测定及分析 ...29
3.3.1 分离株 HA 基因与其他毒株的核苷酸序列的同源性分析 ........30
3.3.2 分离株 HA 基因的遗传进化关系分析 ..30
4 讨论 ..........32
4.1 HA 基因的扩增及克隆 .....32
4.2 HA 基因的序列分析 .......32
5 小结 ..........32
试验二 重组病毒的构建.......33
1 试验材料 ......33
1.1 主要试剂 ....33
1.2 质粒及菌株 ..33
1.3 主要溶液配方 33
1.4 引物合成 ....34
2 试验方法 ......34
2.1 转移载体的构建 .........34
2.2 重组质粒的转染 .........39
2.3 重组病毒的筛选与纯化....40
2.4 重组病毒 HA 基因表达产物 Western-blot 鉴定 ......41
3 结果与分析 ....41
3.1 FPV 复制非必需区 F11L 的 PCR 扩增结果 41
3.2 重组质粒限制性内切酶酶切鉴定.......42
3.3 重组病毒的鉴定 .........46
4 讨论 ..........48
5 小结 ..........50
全文总结 ........51
参考文献 ........52
致谢 .58