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毕业论文-支持细胞作饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞,共21页,12642字,附任务书、开题报告、文献综述等
摘要:探索用小鼠睾丸支持细胞作为饲养层分离培养胚胎干细胞的方法,用小鼠睾丸支持细胞作饲养层,大鼠心肌细胞作条件培养液,接种囊胚或桑葚胚培养,挑取并离散内细胞团接种于饲养层,传代培养,观察胚胎干细胞集落的生长状态,并通过碱性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示内细胞团在饲养层上生长良好,干细胞呈集落状生长,能传代两次并用碱性磷酸酶染色鉴定结果保持未分化状态。故得出小鼠胚胎干细胞能在小鼠睾丸支持细胞作饲养层、大鼠心肌细胞作条件培养液的条件下分离培养。
关键词:小鼠;睾丸支持细胞;大鼠心肌条件培养液;胚胎干细胞
目录
任务书 .……...………..…….………...……..1
文献综述 …….............…….....….….2
开题报告 .…….……....…. 8
正文 ….………...…....11
摘要……......…..........11
前言.….....………... ..11
材料与方法….………...….……..12
试验结果…...……..…...16
分析与讨论..….……......………..18
结 论...……….……...………...19
参考文献….………...……...…….................19
致 谢…….....………..………...19
指导教师评阅表...…........21
交叉评阅表.………...…......……..…22
答辩记录表……...……..……...………...…….23
论文(设计)的主要内容(技术指标)与要求:
主要内容:
1、大鼠心肌条件培养液的制备
2. 小鼠睾丸支持细胞的培养
3. 获取小鼠胚囊
4. 小鼠胚胎干细胞分离培养
5. 胚胎干细胞传代培养及其鉴定
要求:1、收集相关文献资料,并写出综述报告。
2、根据研究内容,提出课题的研究方案(开题报告)。
3、通过支持细胞作饲养层培养胚胎干细胞,并鉴定干细胞。
4、独立毕业论文的撰写。
文献综述:抑制胚胎干细胞分化的研究进展
摘要:小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)是具有自我更新和多向分化能力的胚胎细胞,具有向机体各种组织细胞分化的潜能,故在体外培养胚胎干细胞需要严格的条件,要求ESC既能大量增殖又能保持原有的全能性而不分化,故本文根据文献综述抑制胚胎干细胞在体外培养时分化的多种条件,如饲养层、条件培养基、白血病抑制因子、血清替代物、PD98059等条件。
关键词:小鼠;胚胎干细胞;抑制分化
3.2 研究方法
3.2.1 大鼠心肌条件培养液的制备:取出生当天新生大鼠10只左右,无菌取出心脏,取心室部分,4℃PBS(-)漂洗,剪碎、消化、200目滤网过滤,收集细胞悬液,500 r/min低速离心收集细胞;转移入25cm2培养瓶内,加心肌条件培养液,37℃、5%CO2孵育1h,吸出细胞悬液接种到另一个板,加心肌条件培养液培养;48 h后换液(半量换液)继续培养,72h换液(换成ES细胞培养液)继续培养,培养120h后,收集条件培养液,-20℃保存待用;每天观察心肌细胞的形态和生长状况。
3.2.2 支持细胞的培养:取10只2周龄雄性小鼠,取其睾丸消化,吹打,过滤,接种,37℃、5% CO2培养,观察细胞。当细胞大部分贴壁时,首次换液,培养48h后用20mmol/L的Tris-cl(PH7.2)处理3min,去除残余生殖细胞,以后每72小时换液。
3.2.3 获得囊胚:用常规超排,先打PMSG,48小时后打HCG,然后放公鼠交配,检查母鼠阴道是否有栓塞,如有证明交配成功,隔3.5天取子宫冲囊胚。
3.2.4 胚胎干细胞的培养:将囊胚移入接种饲养层的六孔板中,用ES细胞培养液进行培养,每48h半量换液,37℃、5%CO2培养箱中培养,待内细胞团贴壁生长,5d后挑内细胞团,消化、吹打成小细胞团块,接种于支持细胞饲养层上培养,用ES培养液,37℃、5%CO2培养箱中培养,每48h半量换液。
3.2.5 胚胎干细胞的传代培养:分散的ICM细胞培养3-7 d后,形成的干细胞集落为F1代,将F1代干细胞集落挑出,按照ICM分离法离散F1代干细胞集落,再获得的干细胞集落称为F2代,将F2代干细胞集落挑出,再进行分离传代,并以此方式传代