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人废弃胚胎来源的胚胎干细胞建系研究（硕士学位论文），共54页。
【摘要】 目的人胚胎干细胞起源于囊胚内细胞团，具有无限自我更新及体内外分化成人体任何一种细胞类型的能力，胚胎干细胞全能性特征可为细胞替代治疗及药物筛选提供大量资源。人胚胎干细胞系1998年就已建立，但是胚胎干细胞系的发育潜能和表观遗传特性存在很大差异，导致用于人体移植治疗时会出现HLA免疫排斥问题。国内干细胞株数远不能满足HLA匹配数，还需要建大量不同胚胎来源的干细胞株。在大部分IVF胚胎室，受精卵通常培养至第3天（D3），所有胚胎经形态学评分后，高评分胚胎用于移植或冷冻，低评分胚胎由于发育潜能不足，序贯培养获得囊胚着床率低、死亡率及染色体异常率高，通常予以丢弃。尽管形态学评分目前是大多数生殖中心的胚胎判断标准，但并不是胚胎发育潜能的金标准。本研究收集D3低质量废弃胚胎，序贯培养至D6，囊胚扩张后（3级及以上）行玻璃化冷冻，冻融后培养至D8或D9接种，本研究在常规建系方法基础上进行了改进，尝试用D6天低质量冻融囊胚进行干细胞建系，为人废弃胚胎干细胞建系提供材料和方法学参考。方法（1）囊胚序贯培养、冷冻：本实验开始前已获得安徽医科大学伦理委员会的同意，并且所有提供废弃胚胎的夫妇均已签署知情同意书，同意其废弃胚胎用于科研。收集本中心D3废弃胚胎行序贯培养，获得的囊胚玻璃化冷冻储存。（2）胚胎解冻、培养：胚胎解冻后序贯培养至D8或D9，观察囊胚形态变化，对含有内细胞团的存活囊胚进行接种。（3）接种、传代：接种之前链蛋白酶消化去除透明带，机械打孔成功后接种，待原代集落长出后，将原代集落接种至事先准备好的小鼠饲养层上，7天传代一次。（4）胚胎干细胞特征鉴定：分别取不同代次的胚胎干细胞行碱性磷酸酶染色，干细胞体内外分化，免疫组化荧光染色以及染色体核型分析。结果（1）囊胚形成率：共收集168枚低形态学评分的D3废弃胚胎，参照SteerCV的评分标准，所有胚胎的单胚胎评分均小于16分。序贯培养至D6天共获得低质量囊胚（包括3CB,3BC,4CB,4CC）32枚，复苏后存活26枚，囊胚形成率19.0%，复苏存活率81.3%。（2）复苏、接种后生长状况：复苏后存活的囊胚26枚，均含有不同形状大小的内细胞团，分离出原代克隆8个，其中2个在传代过程中分化，其余2个原代克隆准备传第2代时出现污染。我们从一个4CB及3BC的囊胚成功分离培养出hESC，其中1株已传36代，另一株已传20代。（3）hESC的生物学特性分析：传代过程中的干细胞集落表现出典型的干细胞克隆特征，细胞间连结紧密，与周围饲养层细胞形成明显的界限；碱性磷酸酶AKP染色强阳性；间接免疫荧光着色，干细胞集落高表达OCT-4抗体；完整干细胞集落免疫表型分析显示细胞集落TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4表达阳性。D26，D36染色体核型分析均为正常二倍体核型，46XX。干细胞集落接种到SCID小鼠腹股沟皮下，10周后形成的畸胎瘤可见3个胚层的细胞，包括角化复层扁平上皮（外胚层）、软骨（中胚层）以及肠腺上皮（内胚层）；胚胎干细胞克隆集落体外悬浮培养14天后形成拟胚体状结构。结论临床上D3低质量胚胎经囊胚序贯培养可以形成囊胚；低质量冷冻囊胚经复苏培养接种后可以形成胚胎干细胞原代集落；低质量冷冻来源的胚胎干细胞原代集落可以成功接种传代并保持经典胚胎干细胞特性；临床上低质量废弃胚胎可以成功序贯培养出囊胚并进行胚胎干细胞建系研究。
【关键词】 低质量； 冷冻囊胚； 机械法打孔； 干细胞建系；

目 录
缩略词表 1
中文摘要 2
Abstract 4
引言7
材料与方法10
结果17
讨论33
小结37
参考文献37
附录 40
致 谢 41
综述 42

引言 
多能干细胞所具有的无限自我更新以及定向分化为体内任何细胞类型的能力，使它们在个体发育以及疾病研究中能够提供有力模型，为以后多能干细胞的细胞移植替代治疗疾病带来希望。所谓多能性干细胞 ，一般指的是所有类型的多能性干细胞，其中包括胚胎干细胞（ ES 细胞），诱导性多能干细胞（ iPS 细胞）和胚胎肿瘤干细胞[1,2]。其中胚胎干细胞领域的创新进展开启了再生医学的时代，使得干细胞移植治疗人类疾病成为可能；除了胚胎干细胞研究以外，诱导多能干细胞的发现再一次拓宽了再生医学领域，进一步推动了多能干细胞在细胞替代治疗某些退化性疾病、药物的研发以及筛选、利用干细胞建立疾病模型等领域的研究。只要能成功分离提取多能干细胞，就可以从其功能、表型以及分子水平上进行比较研究。胚胎干细胞以及胚胎肿瘤干细胞是我们比较熟悉的多能干细胞，这两类胚胎干细胞自从其被发现之初，就被广泛应用于科学研究，如干细胞的全能性分析、定向诱导分化、体内外随机分化等全能性的鉴定。人类胚胎干细胞（hESCs）自问世以来[3]，相关研究一直在以惊人的步伐前进。这些多能性细胞的特性使得他们能够分化成任何类型的细胞，包括干细胞那些无限自我更新的治疗潜力。胚胎干细胞为探索个体正常发育规律以及疾病发生等领域提供了有力工具；同时，胚胎干细胞也为临床替代治疗某些疾病如神经系统脊髓损伤、失明、I 型糖尿病等提供研究模型[4]。另一方面，在复杂的人类历史背景以及宗教文化下，破坏人类胚胎来获得胚胎干细胞触碰了伦理道德。而随着 Yamanaka 在 2006 年研究发现将转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 导入小鼠成纤维细胞内，可以重新编程小鼠体细胞达到与胚胎干细胞相似的潜能，这一里程碑式的研究避免了胚胎的破坏[5]，他们这些诱导获得的新细胞命名为“诱导多能干细胞”（iPSCs）。从此，研究者们开始从各个层次比较胚胎干细胞和诱导多能干细胞的异同。iPS 细胞具有与胚胎干细胞.......