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构建RNA结合蛋白表达文库并研究其在信号转导中的调控机制（硕士学位论文），共64页。
【摘要】 转化生长因子-β (Transforming Growth Factor-β或者TGF-β)作为一种重要的细胞因子在细胞的生长、增殖、分化中发挥着非常重要的调控作用。因此,TGF-β信号通路的调控异常与人类多种疾病密切相关如癌症等。在TGF-β信号传递过程中Smads蛋白发挥了重要的作用。Smads家族蛋白根据其结构和功能可以分为三大类,分别是受体激活的R-Smads(如Smad2/3),通用转导的Co-Smad,以及抑制型的I-Smads,在经典的TGF-β信号通路中,配体与细胞表面的受体结合,从而引起R-Smads的磷酸化。磷酸化的R-Smads与Co-Smad结合形成三聚体进入细胞核,结合到特定的DNA序列从而调控下游基因的表达。在TGF-β信号通路中,转录水平的研究已经比较清楚,但是转录后水平的调控机制还不是非常清晰。基因在转录后,需要经过剪接加工成为成熟的mRNA,最后翻译成为蛋白质。经典的转录后剪接加工调控主要是通过RNA结合蛋白识别mRNA上的增强或抑制单元来实现的。在TGF-β信号通路中,RNA结合蛋白如何参与其转录后调控的机制还不清晰。本研究拟以构建RNA结合蛋白文库为载体,结合细胞水平和分子水平的实验,研究RNA结合蛋白在TGF-β信号通路中的调控作用。根据RNA结合蛋白数据库中的信息,在人类细胞中有235个蛋白含有一个或多个RNA结合单元(RNA Recognition Motif或者RRM)。对照cDNA文库(Human ORFeome5.1),我们获得了112个RNA结合蛋白的cDNA。通过Gateway系统,我们将文库中的cDNA成功构建到慢病毒载体上,并在293T细胞中进行了表达检测,其中86个可以正确表达蛋白。然后我们利用TGF-β荧光素酶报告系统SBE-luc在HaCaT细胞中进行初步筛选并发现调控TGF-β多个重要蛋白。我们围绕其中一个蛋白RBP75进行了深入研究,实验证实RBP75可以促进TGF-β信号通路,从而促进细胞发生上皮细胞-间充质细胞转化(Epithelial Mesenchymal Transition或EMT)。进一步研究证实,RBP75的RNA结合单元能够直接与蛋白Smad2/3相互作用,从而促进TGF-β信号通路的转导。这为研究RNA结合蛋白在癌症细胞转移中的调控机制提供了新的参考依据。
【关键词】 RNA结合蛋白； TGF-β信号通路； EMT；

目 次
致谢 I
申文摘要 III
Abstract V
目次
1 51 言 1
l.lTGF-p信号通路 1
1.2 TGF-P诱导 EMT 3
1.3RNA结合蛋白 5
1.4 TGF-P信号通路中的RNA结合蛋白 7
2实验材料与方法 9
2.1实验材料 9
2.2实验方法 15
3实验结果 24
3.1 RNA结合蛋白文库的构建和筛选 24
3.2过量表达RBP75促进TGF-p信号通路 30
3.3敲减RBP75抑制TGF-p信号通路 35
3.4 RBP75的RRM结构域直接与Smads的相S作用 38
3.5 RBP75的RRM结构域促进TGF-p信号通路 43
4讨论 45
参考文献 48
作者简介和科研成果 54