银杏叶提取物对腺样囊性癌ACC-2细胞凋亡及Survivin、TIP30基因表达的影响
摘要 目的：探讨银杏叶提取物(EGB)对泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞增殖、凋亡及Survivin、TIP30基因表达的影响。方法：体外培养人泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞，应用MTT法检测细胞增殖；Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期；RT-PCR和Western blotting分析Survivin、TIP30基因表达。结果：EGB对ACC-2细胞的体外增殖具有抑制作用，量效关系显著，与对照组比较有统计学差异(P﹤0.01，半数抑制浓度50%(IC50)为88 mg/L。经流式细胞仪检测表明，EGB能使ACC-2细胞G0-G1期逐渐增加，G2-M期和S期逐渐减少，并且随着剂量的增加，ACC-2细胞凋亡率明显增加(P﹤0.05或P﹤0.01)。EGB对ACC-2细胞Suivivn基因表达有一定的抑制作用，同时促进TIP30基因的表达。随着EGB浓度的升高，Survivin基因表达明显减少(P﹤0.01)，而TIP30基因表达则显著提高（P﹤0.01）。结论：EGB能有效抑制人泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞Survivin基因表达并促进TIP30的表达，诱导ACC-2细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。
关键词：银杏叶提取物；ACC-2细胞；增殖；凋亡；Survivin基因；TIP基因
泪腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是泪腺恶性上皮性肿瘤中最为常见并且恶性程度最高的肿瘤，其发病率约占泪腺上皮性肿瘤的29%，仅次于多形性腺瘤，居于第2位 , 。其对常规放、化疗不敏感，以手术治疗为主，但由于该肿瘤生长具有较强的浸润性，好沿神经侵袭生长 ，手术无法根除，术后复发率高且远期疗效较差，治疗比较棘手。因此，探求新的治疗方法已成为ACC研究的新方向。
银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba, EGB)对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，能诱导多种肿瘤细胞凋亡 , ，并能增强化疗药物的抑瘤作用，但其对ACC的抗肿瘤作用及其机制研究尚未见报道。Survivin是近年新发现的凋亡抑制因子，通过抑制Caspase级联反应下游的Caspase-3和Caspase-7活性，起到抑制细胞凋亡的作用，是目前肿瘤相关基因研究的热点问题之一 , 。TIP30是一种抑癌基因，可特异性作用于HIV-I长末端重复序列的蛋白，具有抑制细胞增殖，促进细胞凋亡及抑制细胞血管生成的作用。本研究通过观察EGB对泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞增殖、凋亡及Survivin、TIP30基因表达的影响，探讨EGB可能的抗肿瘤作用机制，为其进一步临床应用提供实验依据和理论基础。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
银杏叶提取物（EGB761，商品名：金纳多），德国威玛舒培博士药厂生产，批号：1140808。RT-PCR试剂盒购自德国Qiagen公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；Survivin抗体、TIP30抗体购自美国Santa Cruz公司；RPMI-1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；MTT、二甲基亚砜、琼脂糖购自美国Amresco公司；Trizol总RNA抽提试剂购自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、Oligod、RNAsin购自美国Promage公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.2 细胞株
人泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞购于中国科学院上海生命科学研究院。用含10%胎牛血清、2%的谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
1.3 仪器设备
CO2培养箱(MCO175，SANYO)；倒置显微镜 (IX-70，Olympus)；水平流超净工作台(ZHJH-2112)；流式细胞仪 (FACS Calibur, Becton Dickinson)；PCR扩增仪(Roche)；酶标仪(ELX800型)。
1.4 方法
1.4.1 MTT法测定细胞增殖 取对数生长期的ACC-2细胞制成2×107•mL－1细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24h。然后加入EGB100μL，使其终浓度分别为0、10、20、40、80、160mg/L，同时设对照孔和调零孔，每组6个复孔。继续培养48 h后，每孔加入20μL MTT溶液(5g/L)，再培养4h后吸去全部上清液，然后每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡摇匀终止反应，使用酶标仪在490 nm处测吸光度(A)值。计算肿瘤细胞增殖抑制率。
肿瘤细胞增殖抑制率=(对照组A值－药物组A值)/对照组A值×100%
1.4.2 Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率 取对数生长期的ACC-2细胞制成1×106•mL－1细胞悬液，接种于12孔培养板中，每孔2mL，加入EGB使其终浓度分别为0、10、40、160 mg/L。培养48 h后，调整待测细胞浓度为1×106•mL－1，取1mL细胞悬液，1000 r/min 4℃离心10 min弃上清，加入1 mL冷PBS重悬细胞，再重复离心，弃上清，加入200μL结合缓冲液重悬，再加入10μL Annexin V-FITC、5μL PI，混匀，室温避光孵育15 min，加入300μL结合缓冲液，立即用流式细胞仪进行检测细胞凋亡率并分析细胞周期。
1.4.3 RT-PCR检测Survivin和TIP30 mRNA的表达 取对数生长期的ACC-2细胞，培养24h，加入EGB使其终浓度分别为0、10、40、160 mg/L，继续培养48 h后，用Trizol试剂提取细胞总RNA，电泳检测RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板PCR扩增Survivin，β-action为内参照基因。Survivin上游引物5’-GGCACCAGAGGCAGTAACCA-3’，下游引物5’-GGACCTTCGGTGACTGATGATCTAA-3’；β-action上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物5’-AGTCTT- TCTGGGTGGCAGTGAT-3’。反应条件为：首先95℃预变性5 min；然后94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。
以cDNA为模板PCR扩增TIP30，β-action为内参照基因。TIP30上游引物5’-GTCTTTATTTTGGGCGCCAG-3’，下游引物5’-CCCAGCTTTCCCTCTGGTGG-3’；β-action上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物5’-AGTCTT- TCTGGGTGGCAGTGAT-3’。反应条件为：首先95℃预变性5 min；然后94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。分别取两种基因的PCR产物12μL于2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统观察记录结果。
1.4.4 Western blotting检测Survivin、TIP30基因表达 取0、10、40、160mg/L EGB作用48 h后的ACC-2细胞，各收集1×107个细胞，加入200μL蛋白裂解液，于4℃裂解1h，12000 r/min 4℃ 离心20 min取上清，用考马斯亮蓝蛋白质测定法测定蛋白浓度。取80μg样品总蛋白变性10min后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离的蛋白带电转至PVDF膜上，经5%BSA 37℃封闭1 h，加入抗Survivin的单克隆抗体或抗TIP30的单抗4℃孵育16h，洗膜3次。再加入羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，洗膜3次。化学发光显色检测分析结果。对蛋白条带灰度进行相对定量分析，并以β-action条带作为参照。Survivin相对含量= Survivin灰度值/β-action灰度值，Survivin表达抑制率=1-药物组Survivin相对含量/对照组Survivin相对含量；TIP30相对含量=TIP30灰度值/β-action灰度值。
1.5统计学方法
用SPSS15.0软件进行统计学处理，计量资料以 ±s表示，采用t检验或单因素方差分析，率的比较采用χ2检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EGB对ACC-2细胞增殖的抑制作用
EGB不同浓度对ACC-2细胞的体外增殖均有一定的抑制作用，并且随着EGB浓度的增高，抑制作用也在增强，量效关系显著。各剂量组与对照组比较均有统计学差异(t=11.67, 16.31, 22.01, 24.18, 26.68, P﹤0.01)；经 Logit方法计算半数抑制浓度(IC50)为88 mg/L。见表1。
2.3 Western blotting分析EGB对Survivin、TIP30基因表达的影响
随着EGB浓度的升高，Survivin、TIP30基因表达明显减少，量效关系明显。见图1。
图1 Western blotting分析EGB对Survivin、TIP30基因表达的影响
2.4 EGB对ACC-2细胞Survivin、TIP30基因相对含量及Suivivin基因表达抑制率的影响
EGB不同浓度对ACC-2细胞Survivin基因均有一定的抑制作用，并且随着EGB浓度的增高，抑制作用也在增强，量效关系显著；与之相反，TIP30基因的相对含量则随着EGB给药剂量的增大而逐渐增高。各剂量组与对照组比较均有统计学差异(t=8.77, 10.04, 15.59, P﹤0.01)。见表3。
3 讨论
泪腺腺样囊性癌是一种浸润性强预后差的肿瘤，其发病机制及治疗一直是临床亟待解决的重要课题，虽经多年研究，目前仍未找到有效的治疗手段。由于中药具有多途径、多靶点、毒副作用低等优点，已成为抗肿瘤研究的热点之一。EGB是从银杏叶中分离纯化的有效组分，主要含有黄酮和内酯类化合物，临床主要用于心、脑血管及外周循环障碍性疾病 , 。近年来，有研究证明EGB具有一定的抗肿瘤活性，对胃癌 、肝癌 、肠癌 及乳腺癌 均有一定的杀伤作用，但其抗肿瘤作用的确切机制尚不十分明确。本研究中EGB不同浓度对ACC-2细胞的体外增殖有一定的抑制作用，并且量效关系显著 (P﹤0.01)，经 Logit方法计算半数抑制浓度(IC50)为88 mg/L。
有研究表明肿瘤的发生、发展不仅与细胞的增殖分化异常有关，还与其凋亡障碍有关 , 。细胞凋亡是一种维持机体自身平衡所必须的生理性细胞自杀过程，受基因调控。本研究采用Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测发现，EGB促进ACC-2细胞凋亡的同时，也使ACC-2细胞周期分布发生明显改变。EGB作用48 h后，停滞于G0-G1期的细胞比例明显增加，而进入S期的细胞比例明显下降，并且这种阻滞效应具有一定的剂量依赖性。提示EGB对泪腺腺样囊性癌细胞ACC-2的增殖抑制作用可能是由于EGB改变了细胞周期的分布，使多数细胞停滞于细胞分化期即G1期，阻止细胞向S期转化，从而减少了DNA合成和有丝分裂并促进其分化。
Survivin是近年来发现的抗凋亡作用最强的细胞调节因子之一，定位于染色体17q25，编码142个氨基酸 ，属凋亡抑制蛋白家族(IAPs)成员。Survivin可抑制Caspase-3的活化，从而阻断细胞凋亡过程，其过度表达可能是肿瘤发生、发展及预后不良的主要因素 , 。研究发现 , ，Survivin选择性表达于恶性肿瘤，并随着恶性程度增高表达增强，而在正常组织中不表达或少量表达。TIP30首先是作为一个抑癌基因被发现的 ，随后其抑癌作用被不断得到研究和证实。Mitsuhiro等 做小鼠基因剔除试验发现剔除TIP30基因的小鼠易自发发生肝癌、输尿管癌和膀胱癌，充分证明TIP30是一个重要的肿瘤抑制因子。本研究采用Western blotting分析Survivin、TIP30基因的表达，结果表明，随着EGB浓度的升高，Survivin基因表达明显减少，TIP30的表达量则随着EGB浓度升高升高。由此结果推测，EGB抑制细胞凋亡通路中Survivin基因表达后，可解除对Caspase-3的抑制而活化细胞凋亡信号转导通路；另一方面，TIP30基因具有促凋亡作用，它通过高表达上调一系列的促凋亡基因的表达以抑制ACC-2细胞的增殖。这些促凋亡基因包括Saiv和Bcl-2家族 的两个促凋亡成员Bad和Bax，还有重要的抑癌基因p53。这或许是EGB诱导泪腺腺样囊性癌ACC-2细胞凋亡的机制和EGB抗肿瘤作用的分子基础。
