不同基因型新城疫病毒对美国白羽王鸽的致病性研究
不同基因型新城疫病毒对美国白羽王鸽的致病性研究
吴 双，王伟伟，曹军平，胡顺林，王晓泉，刘秀梵 *
(扬州大学 农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州 225009)
摘 要：为比较鸽源Ⅵb 亚型新城疫病毒(NDV)与其它不同基因型 NDV 对鸽的致病性差异，本研究选取
JS-7-05-Ch (基因Ⅲ型)、WX-10-07-Pi (基因Ⅵb 型)、JS-5-05-Go (基因Ⅶd 型)和 F48E8 (基因Ⅸ型) 4 个病毒株，分别
人工感染 2 月龄实验鸽。接种后，观察实验鸽临床症状、病理剖解变化、同时检测 HI 抗体水平变化、喉气管和
泄殖腔排毒以及病毒在组织分布情况。4 株 NDV 均能导致接种鸽的发病，但死亡率分别为 0、0、100 %、50 %。
WX-10-07-Pi 接种组鸽泄殖腔排毒时间最长、而且病毒检出率比其它组高。另外，在接种组鸽的多种组织器官中
均可检测出病毒。实验结果表明，不同基因型 NDV 对鸽均有致病性，但致病力强弱与 NDV 毒株特性有关；基
因Ⅵb 型 NDV 在鸽体内可长期的带毒与排毒，与其它基因型 NDV 相比更易在鸽群中传播。
关键词：新城疫病毒；鸽；致病性；排毒
中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1008-0589(2010)06-0424-04
Pathogenicity of different genotypes Newcastle disease viruses
in American White King pigeons
WU Shuang, WANG Wei-wei, CAO Jun-ping, HU Shun-lin, WANG Xiao-quan, LIU Xiu-fan*
(Key Laboratory of Animal Infectious Diseases of Ministry of Agricultural, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)
Abstract: To evaluate the pathogenicity of Newcastle disease virus (NDV) strains of different genotypes in pigeons,
JS-7-05-Ch, WX-10-07-Pi, JS-5-05-Go and F48E8 NDV strains that belonged to genotype Ⅲ, Ⅵ, Ⅶ and Ⅸ, respectively, were
chosen to artificially infect two-month-old pigeons. Clinical symptoms and pathological changes of pigeons were observed, and
humoral antibody response, virus shedding and virus distribution in tissues were examined. The results showed that NDVs could
cause 100 % morbidity in pigeons and the mortality of pigeons infected with genotype Ⅲ-, Ⅵ-, Ⅶ- and Ⅸ-infected groups was 0, 0,
100 % and 50 %, respectively. Pigeons infected with WX-10-07-Pi experienced longer time in virus shedding and showed higher
ratio of virus isolation when compared with other pigeons, which indicated that the Ⅵb NDVs might have genetic advantages over
other genotypes in NDV outbreaks in pigeons.
Key words: Newcastle disease virus; pigeons; pathogenicity; virus shedding
收稿日期：2009-10-26
基金项目：国家自然科学基金重点项目(30630048)；“十一五”国家支撑计划项目(2006BAD06A03)
作者简介：吴 双(1983-)，女，江苏徐州人，博士研究生，主要从事新城疫病毒分子生物学和蛋白质组学研究.
* 通信作者：E-mail：xfliu@yzu.edu.cn
*Corresponding author
中国预防兽医学报
Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine
第 32 卷 第 6 期
2010 年 6 月
Vol. 32，No.6
Jun. 2010
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于
副粘病毒科，禽腮腺炎病毒属。NDV 为单股负链不
分节段 RNA 病毒，主要编码 6 种病毒蛋白，基因
组长约 15 kb。新城疫(ND)是危害养禽业的重要传
染病之一，给许多国家的养禽业造成巨大经济损失[1]。
尽管 NDV 只有 1 个血清型，但不同基因型毒株之
间的生物学特性存在明显差异。根据致病力的不
同，NDV 通常分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。
鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副粘病毒(Pigeon paramyxovirus
type 1，PPMV-1)引起的一种高度接触性传染病，是
严重危害养鸽业的主要疫病之一[2]。多数学者认为，
PPMV-1 是鸡 NDV 的一种变异株 [3]，值得注意的是
大部分鸽源病毒株 F 蛋白裂解位点序列虽然为强毒
特征，但它们对鸡的致病力却不强，主要呈中等毒力[4]。
研究表明，鸽群中所分离的 NDV 绝大多数属
于基因Ⅵb 型，与当前世界上流行的优势基因型并
不一致，表明Ⅵb 型 NDV 对鸽具有明显的宿主适应
性。但迄今为止，Ⅵb 亚型与其它基因型 NDV 对鸽
的致病性尚无详尽报道。为了比较不同基因型 NDV
对鸽的致病性差异，本研究选择了 4 个不同基因的
NDV 强毒株，分别进行鸽的人工感染试验，并对接
种后鸽的临床症状、病理变化、排毒规律、抗体变
化及组织嗜性差异进行了研究。
1 材料和方法
1.1 病毒株和实验动物 基因Ⅲ型鸡源 NDV 分离
株 JS-7-05-Ch、Ⅵ型鸽源 NDV 分离株 WX-10-07-Pi
和Ⅶ型鹅源 NDV 分离株 JS-5-05-Go 均为本实验室
近期分离，经鸡胚成纤维细胞(CEF)噬斑纯化 3 次
后 SPF 胚传代 3 次[5]；基因Ⅸ型病毒株 F48E8 由本实
验室保存。SPF 鸡胚购自山东家禽研究所。2 月龄
美国白羽王鸽购自江都飞亚肉鸽养殖基地。实验前
血清检测证明，所有实验鸽均无 NDV 和禽流感病
毒抗体。
1.2 主要仪器和试剂 7300 型实时荧光定量 PCR
扩增仪，TaqMan Universal PCR Master Mix Kit 为 ABI
公 司 产 品 ；TRIzol 抽 提 试 剂 购 自 Invitrogen 公 司 ；
M-MLV 反转录酶和 RNasin 购自 Promega 公司。
1.3 病毒毒力及 ELD50 测定 1 日龄雏鸡脑内接种
致病指数(ICPI)，6 周龄鸡静脉接种致病指数试验
(IVPI) 和最低致死 量致死鸡胚的平均死 亡 时 间
(MDT)按照文献标准进行[6]。用 Reed-Muench 法计算
鸡胚半数致死量(ELD50)。
1.4 鸽致病力试验 将 2 月龄美国白羽王鸽分组，
每组 10 只，另取 5 只作为阴性对照组，隔离饲养。
每只试验组鸽滴鼻、点眼接种 106 个 ELD50 的病毒
剂量。将 F48E8 感染组作为阳性对照，阴性对照组鸽
接种同体积的 PBS。接种后观察 30 d，记录实验鸽
的临床症状及发病死亡情况；并定时采集泄殖腔棉
拭子。
1.5 血清抗体的测定 于接种后第 7 d、14 d 和 21 d
采血，血清于 -20 ℃保存，统一用 1 %健康鸡红细
胞，以 4 个血凝单位 LaSota 病毒为抗原，采用 β
微量法测定 HI 滴度。
1.6 实时 RT- PCR (RRT- PCR)检测组织中病毒的
分布
1.6.1 引物设计 根据文献[7]合成 NDV 的 1 对特
异引物及相应的探针。扩增片段位于 M 基因的保守
区。引物由上海生工生物工程有限公司合成，探针
由 TaKaRa 公司合成。预期扩增的片段为 146 bp。
上 游 引 物 ： 5'-AGTGATGTGCTCGGACCTTC-3'， 下
游引物：5'-CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA-3'；探针：
5'-[FAM] TTCTCTAGCAGTGGGACAGCCTGC [TAM
RA]-3'。
1.6.2 组织样品处理 于接种后第 4 d、7 d 和 14 d
分别随机取两只鸽子(对照组取 1 只，濒死鸽随时解
剖，存活鸽于第 30 d 解剖)进行病理解剖，记录剖
检变化情况。采集气管、肾脏、脾脏、肺脏、肝
脏、胰腺、十二指肠以及胸腺 8 种组织。按 1 g 组
织样品加 3 mL 预冷 PBS 进行研磨，反复冻融 3 次
后取上清，每份取 250 μL 上清用于 RNA 的提取。
1.6.3 RRT-PCR 检测 按 TRIzol 法提取 8 种组织
样品总 RNA，以 6 碱基随机引物逆转录合成 cDNA
进行 RRT-PCR 检测。其反应体积为 50 μL。并设阳
性对照、阴性对照和定量标准品孔。反应程序为：
95 ℃ 15 min；94 ℃10 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s，
共 40 个循环。荧光信号的收集及数据的采集定在
52 ℃。检测结束，根据噪音情况设定和调整基线及
阈值，根据荧光曲线和 Ct 值判断结果。
2 结 果
2.1 4 株 NDV 的致病性 4 株病毒的部分生物学
特性进行测定结果见表 1，综合 MDT，ICPI 和 IVPI
实验数据显示，JS-5-05-Go、JS-7-05-Ch 和 F48E8 为强
毒株，WX-10-07-Pi 为中等毒力株。
2.2 临床症状和剖解病变
2.2.1 实验鸽发病及死亡情况 接种后 48 h 左右，
JS-5-05-Go 和 F48E8 试验组的鸽表现出明显的临床症
状；接种后 72 h，WX-10-07-Pi 和 JS-7-05-Ch 仅表现
出轻微的精神状态不佳。病鸽的临床表现主要有：
体温升高；发病初期粪便呈黄白色或黄绿色或水样
稀粪，后期为墨绿色粘性稀粪，耐过的病鸽粪便性
吴 双，等. 不同基因型新城疫病毒对美国白羽王鸽的致病性研究第 6 期 425
状逐渐正常；眼睑发炎、眼睛半睁半闭，呼吸困
难、咳嗽；大部分病鸽表现出翅膀悬垂或向两侧分
开，两脚麻痹、呈劈叉姿势，并伴有阵发性痉挛瘫
痪、转圈或震颤等神经 症 状。只 有 JS-5-05-Go 和
F48E8 试验组的鸽出现死亡，死亡高峰期集中在接种
后 5 d ～9 d。在 1 个月的实验期内，试验组鸽发病
率 为 100 % ； 除 去剖解的病鸽外，F48E8 和
JS-5-05-Go 试验组的死亡率分别为 50 %和 100 %，
WX-10-07-Pi 和 JS-7-05-Ch 组未见死亡。所有耐过的
病鸽精神尚好，但明显消瘦。阴性对照组鸽未表现
出异常症状。
2.2.2 病理解剖学变化 死亡鸽子脾脏肿大、颜色
呈黑铜色、表面有针尖至粟粒大的灰白色的坏死结
节或伴有出血点，肝脏呈土黄色，边缘、表面及心
叶有出血点和出血纹，胰脏肿大、有出血点，部分
胸腺肿大、充血，鼻腔、喉头和气管内存有浆液性
渗出物，气管和喉头充血、出血，小肠和直肠有弥
漫性出血点。
2.3 泄殖腔排毒检测 每个泄殖腔棉拭子接种 3 个
9 日龄～10 日龄非免疫鸡胚，接种鸡胚的死亡时间
在 36 h～96 h 之间。JS-7-05-Ch 和 F48E8 接种组仅有
个别棉拭子检测 到 病毒，JS-5-05-Go 和 WX-10-
07-Pi 接种组的棉拭子中病毒分离率较高，实验结果
见表 2。
2.4 抗体变化 4 株病毒感染鸽后分别于第 7 d、
14 d 和 21 d 翅静脉采血，分离血清进行 HI 试验，
结果见表 3。阴性对照组的 HI 结果为 0。
2.5 RRT- PCR 技术检测各组织脏器中病毒的分布
检测结果表明，脾脏、胸腺和肺脏中病毒的检出率
较高；其余组织检出率较低，其中，胰腺中病毒的
检 出 率 最 低 ； JS-5-05-Go 实 验 组 的 检 出 率 最 高 ，
WX-10-07-Pi 组和 F48E8 组检出率相当，JS-7-05-Ch 组
检出率最低。本实验中，呼吸系统的检出率高于消
化系统，特别是滴鼻和点眼接种似乎偏重于呼吸道
症状，与文献报道的一致 [8]。各组织脏器中病毒检
出结果见表 4。
3 讨 论
目前 NDV 对鸽的致病性的研究仅限于临床症
状、泄殖腔排毒和抗体变化，很少涉及到组织学病
理变化以及病毒在组织器官中的分布等方面，研究
不同基因型(中等毒力和强毒株) NDV 同时感染鸽的
实验研究数据目前还比较缺乏。
本 实 验 中 ，鸡 源 JS-7-05-Ch、 鸽 源 WX-10-07-
Pi、鹅源 JS-5-05-Go 和鸡源 F48E8 (基因型分别为Ⅲ、
Ⅵb、Ⅶd 和Ⅸ)感染美国白羽王鸽，仅 JS-5-05-Go
和 F48E8 能够引起感染鸽的死亡。剖检病理变化主要
出现在脾脏、肝脏、肠和胰腺等器官，但其出现比
例和严重程度都不很高，有个别病鸽虽然临诊症状
相当严重，剖检病变却并不显著，与文献报道一致[9]。
RRT-PCR 检测结果表明虽然不同基因型的
NDV 都能在鸽体内进行复制，但各 NDV 对鸽组织
脏器的亲嗜性 强 弱有一定 的 差 别。 WX-10-07-Pi、
JS-5-05-Go 和 F48E8 组的胸腺、脾脏和肾脏的病毒检
表 1 4 个病毒生物学特性及其登录号
Table 1 Biological characteristics and accession
numbers of four isolates
病毒
Virus strain
WX-10-07-Pi
JS-7-05-Ch
JS-5-05-Go
F48E8
基因型
Genotype
Ⅵb
Ⅲ
Ⅶd
IX
宿主
Host
Pigeon
Chicken
Goose
Chicken
MDT
(h)
67.0
46.8
48.0
48.0
EID50
(0.1 mL)
108.14
108.50
108.50
108.75
1.40
1.88
1.96
1.88
0.88
2.18
2.55
2.42
登录号
Accession number
FJ766526
FJ430159
EU044798
FJ436302
ICPI IVPI
表 3 NDV 接种后血清中平均抗体效价检测
Table 3 Titeration of HI titers in pig serum after
inolulation with viruses
病毒
Virus strain
WX-10-07-Pi
JS-7-05-Ch
JS-5-05-Go
F48E8
7 d
1∶8.6
1∶21.1
1∶3.2
1∶8.0
14 d
1∶42.2
1∶21.1
1∶16.0
1∶11.3
21 d
1∶39.4
1∶13.0
-a
1∶16.0
HI 抗体效价 Mean HI titers
-a: died
表 4 NDV 在不同组织中检出率
Table 4 The detection of NDV distribution among tissues
十二指肠
Duodenum
10%
0
30%
10%
胰腺
Pancreas
20%
0
10%
0
肝脏
Liver
0
10%
30%
10%
气管
Trachea
10%
0
30%
30%
肺脏
Lung
50%
0
20%
30%
胸腺
Thymus
20%
0
40%
30%
脾脏
Spleen
30%
10%
30%
10%
肾脏
Kidney
30%
0
30%
20%
WX-10-07-Pi
JS-7-05-Ch
JS-5-05-Go
F48E8
组织中病毒分离率 Virus isolation rate from different organ tissues (n=10)病毒
Virus strain
表 2 JS-5-05-Go 和 WX-10-07-Pi 接种后
泄殖腔棉拭子分离病毒结果
Table 2 Isolation for viruses from cloacal swabs in
pigeons after inoculation with JS-5-05-Go and WX-10-07-Pi
dPI a: Day of post infection； -b: died
病毒
Virus strain
WX-10-07-Pi
JS-5-05-Go
4
0/10
0/10
5
5/8
3/8
6
4/8
2/8
7
3/8
4/8
8
4/6
3/5
9
5/6
0/4
10
4/6
2/3
11
4/6
1/2
12
5/6
0/1
13
2/6
0/1
14
1/6
0/1
15
2/4
-b
16
0/4
-
17
0/4
-
接种天数 dPIa (Number of positive cloacal / total number of pigeons)
中国预防兽医学报 2010 年426
出率相当；WX-10-07-Pi 组的肺脏中病毒检出率明显
高于其他 3 组，表明 WX-10-07-Pi 对鸽的呼吸道亲
嗜性可能最强。
在发病初期，尽管 4 个基因型 NDV 感染鸽的
临床症状相似，但是只有基因Ⅶd 亚型和基因Ⅵb
亚型毒株导致鸽泄殖腔出现排毒。实验结果表明，
尽 管 F48E8 对鸽的致病性明显强 于 Ⅵb 亚 型 毒 株
WX-10-07-Pi，但感染鸽泄殖腔却极少检测到排毒，
一定程度上表明，古老的基因型(Ⅲ和Ⅸ) NDV 不易
在鸽群中传播。与 JS-5-05-Go (Ⅶd)相比，WX-10-
07-Pi (Ⅵb)感染组鸽的泄殖腔棉拭子在感染后第 5 d
至 15 d 内均可检测到排毒，而且排毒率明显高于
JS-5-05-Go 感染组。结果表明，鸽源毒株 WX-10-07
-Pi 感染鸽后，其在体内的带毒时间长且排毒率明显
高于其它基因型 NDV 感染组。由于感染基因Ⅵ型
NDV 的鸽的临床症状很轻，这些患病鸽生活习性改
变不大；而感染基因Ⅶ型 NDV 的鸽的临床症状相
当严重，死亡率可达 100 %，限制了鸽的活动。同
时，基因Ⅵ型 NDV 感染鸽的泄殖腔排毒时间长、
泄殖腔的病毒检出率高。从临床症状、泄殖腔的排
毒时间以及泄殖腔的病毒检出率可以部分解释基因
Ⅵb 亚型 NDV 比基因Ⅶd 型 NDV 更易在鸽群传播。
这些结果一定程度上验证了目前在我国Ⅵb 亚型是
鸽群中所特有的基因型，鸽源 NDV 分离株绝大多
数属于该亚型。值得注意的是，虽然基因Ⅶd 型毒
株 JS-5-05-Go 首次在鸽体内进行实验，但是接种后
也能在泄殖腔中排毒，而且感染鸽的发病程度与死
亡率明显高于Ⅵb 亚型毒株 WX-10-07-Pi，因此，鸽
群感染Ⅶd 亚型并造成发病和流行的风险依然存在。
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(本文编辑：赵晓岩)
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