蛋白酶酶促反应动力学研究
蛋白酶酶促反应动力学研究
一、 原理
酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，时酶促反应的特征常数。不同酶的Km值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。
酶的活力就是酶催化反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。
酶活力可以被某些物质改变，凡能降低酶的活力甚至使酶失活的物质，均称为抑制剂，其中又有可逆抑制和不可逆抑制两种类型。而可逆抑制又包括竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如Km，Vmax等，可通过作图法求得，作图法很多，最常用的就是Lineweaver-Burk作图法（即双倒数作图法）。
二、 仪器和试剂
1、仪器
分光光度计；0.1mL移液管、0.5mL移液管、10mL移液管；恒温水浴；10000rpm离心机2台；pH计一台
2、试剂
50mM PBS（Ph7.6）；1%Azocasein 100mL；1mg/mL Arazyme 溶液；10%TCA；1M NaoH；0.2M 乙酸—乙酸钠缓冲液（pH4.0 5.0 6.0）；0.2M PBS缓冲液（pH7.0）；0.1M Tri-Hcl（pH8.0 9.0 10.0）
三、 实验项目
1. 时间作用曲线的绘制
注：实验过程中要注意空白1号管在添加酶液之前先加10%TCA
所得实验数据如下表
表一
以 OD值为纵坐标，时间为横坐标绘制时间曲线。（图一）
结果分析：由图可知在20min之前OD值随着时间的延长而逐渐增大，这是因为此时底物和酶都比较充足，反应速度与时间基本上呈正比例，但随着反应的进行OD值又不发生变化（20min之后），即反应停止。原因可能有两个，一是底物已完全反应完，反应结束；二是底物还有剩余但酶已达到饱和，不能再与底物结合，反应不能继续进行。
结论：在反应的开始阶段酶促反应的速度随时间的延长而不断增大，反应达到一定时间后速度不再变化，反应停止。
2、底物浓度对酶促反应速度的影响及米氏常数的测定
2.1 底物浓度对酶催化反应速度的影响
所得实验数据如下(表二、表三)
表二
注：0号管为空白
表三
利用以上数据，以底物浓度（%）为横坐标，v（△OD/min）为纵坐标绘制底物浓度对酶促反应的影响曲线。
图二
说明：因为第一个数据与其他的数据差距较大，所以作图时将其舍去。
第一个数据的误差分析：在测定OD值过程中可能比色皿没有用蒸馏水洗，所以数据是上一次测定的另一组的最后一个数据；也可能是最后忘记稀释，直接就测定了，导致数据偏大。
结果分析：实际上应该是随着底物浓度的增大，酶促反应速度也逐渐增大，达到一定程度后速度不再变化，因为酶已经饱和，不能再结合底物，反应以固定的速度进行。从图中可以看出此次实验中酶促反应速度一直随底物浓度增加而增加，且刚开始变化较大，最后趋于平衡，原因可能是实验中的酶是过量的，还没达到酶的最大饱和度。
结论：在酶浓度一定的情况下，随着底物浓度的增加酶促反应速度不断增大，到一定程度后酶达到饱和，反应速度不再变化，反应达到平衡。
2.2米氏常数的测定
以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，作图。利用Lineweaver-Burk双倒数直线方程求解Km和Vmax。
1/Vo=Km/(Vmax[S])+1/Vmax
由图三可得：令1/V=x, 1/[S]=y
Y=30.407x+50.211
当x=0时，y=50.2111,即1/Vmax=50.211, Vmax=0.0199
当y=0时，x=-1.651 Km=0.606
所以，Vmax=0.0199，Km=0.606，R?2=0.9947
3、温度对酶促反应的影响
所得实验数据如下（表四）：
表四
数据处理如下（表五）： 表五
结果分析：从图四可以得出酶促反应速度与温度大致呈钟型曲线，反应的最适温度大约在35℃左右，在35℃以前反应速度随温度升高而增大，35℃时反应速度达最大，35℃之后反应速度逐渐降低，60℃以上反应速度基本为0，因为酶随温度升高活性增大，但酶都有最适反应温度，之后温度再增大就会使酶活性降低甚至失活，此次实验中存在失误，应该在10左右也设计实验，进行验证，这样得出的钟型图才标准。
结论：在酶最适反应温度之前，酶的活性随温度升高而增强，达最适温度后温度再升高酶活降低，最后使酶失活，反应无法进行。
4、PH值对酶促反应的影响
所得实验数据如下（表六）：
表六
数据处理如下（表七）：
表七
注：由于PH6.0 所得的数据中空白值大于样品值，试验中出现了失误和误差，为了得到准确的曲线趋势，所以作图的时候舍去。
数据误差分析：
①由于Azocasein 是一种蛋白质，是微生物生长的合适环境，所以极易被微生物污染，而本次试验中的Azocasein是几天前配置的，可能已经被微生物污染，已经失活，导致实验误差。
②在测定OD值时空白和样品颠倒，或者标签贴错了。
③酶在PH 为4.0的时候已经失活，且是样品中的酶失活比空白中的严重。
④Azocasein 和Arazyme都应该用各自相应PH的缓冲液配置，而实验中不是，所以也使实验存在误差。
结果分析：从图五中可看出pH与酶促反应速度也是呈钟型曲线，其最适pH值在7.0左右，在7.0之前随pH增大酶促反应速度也增大，在7.0之后随pH增大速度逐渐降低，原因是pH过高或过低都会使酶的活性降低，甚至失活，实验中应再设置pH为3.0的一组，这样得出的曲线会更标准。
结论：在酶的最适PH之前，PH增大，其酶的活性增强，超过最适PH酶活随其增大而降低，PH过高或过低都会使酶失活。
四、实习感受
经过一周的实习实验，对于蛋白酶酶促反应动力学的各影响因素我有了更深的了解，在动手实验操作上有了很大进步，但在一些操作细节上还有待提高。尤其在与组员的的合作上比较愉快，一起高效的完成任务。期待这样的实习机会。
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