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MCM5和p16蛋白在肺腺癌组织中的表达及其临床意义

【摘要】  　　目的 检测微小染色体维持蛋白5(MCM5)、p16蛋白在肺腺癌组织中表达的改变及其在癌发生发展中的作用。方法 采用免疫组织化学SP法检测60例肺腺癌、30例支肺脓肿等非癌病变旁正常肺组织中MCM5、p16蛋白的表达情况。结果 60例肺腺癌组织中MCM5蛋白的阳性表达率为100%，与正常对照组的表达差异有高度显著性（P＜0.01）。肺腺癌组织中p16蛋白阳性表达率为71.67%（43/60），显著低于100%阳性表达的正常对照组（P＜0.01）。肺腺癌组中MCM5、p16蛋白的阳性表达与组织学分级有关（P＜0.01）；癌组中MCM5蛋白的阳性表达与淋巴结转移有关（P＜0.01），而p16蛋白的阳性表达与淋巴结转移无关（P＞0.05）。学海网(www.xuehai.net)MCM5与p16蛋白的表达与肺腺癌的年龄、肿瘤大小、组织学类型及TNM分期无关（P＞0.05）。MCM5蛋白的阳性表达与p16的表达呈负相关（r=-0.4920，P<0.01）。结论 MCM5蛋白的高表达可能涉及了人肺腺癌的发生、发展过程，MCM5蛋白的高表达与癌细胞的增殖、侵袭和转移有关，MCM5的检测可作为评价肺腺癌癌细胞的增殖状态、预测肺腺癌临床预后、指导临床治疗的重要生物学指标。p16基因改变在肺腺癌的发生中起重要作用，p16蛋白是肺腺癌早期诊断的有用指标。

【关键词】  肺肿瘤 MCM5 p16 免疫组织化学

　　Abstract:  Objective  To outline the significance of minichromosome maintenance proteins 5 (MCM5) and p16 protein expression and to evaluate their correlations with carcinogenesis and tumor progression in lung adenocarcinoma.  Methods  The SP immunohistochemical technique was used to detect the expression of MCM5 and p16 in 60 cases of lung adenocarcinoma, and 30 cases of normal lung tissues of non-cancerous lung  disease (bronchial pulmonary abscess, etc).  Results  The  expression of positive MCM5 in 60 cases of lung adenocarcinoma was 100.00%, it was significantly higher than that in normal lung tissues (P<0.01). The  expression of positive p16 in lung adenocarcinoma was 71.67% (43/60), this was significantly lower than that in normal lung tissues (100.00%) (P<0.01). The expressions of positive MCM5 and p16 protein were associated with histological grading in lung adenocarcinoma (P<0.01), MCM5 protein positive expression was associated with axillary lymph node metastasis in lung adenocarcinoma  (P<0.01) , and p16 protein was not (P＞0.05) . MCM5 and p16 protein positive expressions had no correlation with age, tumor size, histological classification and TNM stage (P＞0.05). MCM5  was negatively correlated with the expression of p16 (r=-0.4920, P<0.01).  Conclusions  High expression of MCM5 protein may play an important role in the pathogenesis and development of lung adenocarcinoma. The high expression of MCM5 was associated with cell proliferation, invasiveness and metastasis of lung adenocarcinoma. The detection of MCM5 protein may be a useful predictor of cell proliferation, biological behavior and prognosis of  lung adenocarcinoma. p16 gene mutation plays an important role in pathogenesisof lung adenocarcinoma, and p16 protein may be an early event.
   
　　Key words:  lung neoplasms; MCM5; p16; immunohistochemistry   

　　肺癌是人类常见的恶性肿瘤之一，肺癌的发生、发展是一个多因素共同参与的多阶段复杂生物学过程，与细胞增殖和凋亡之间的动态失衡相关。细胞周期中任何一个调控环节的失控都可导致细胞增殖的异常，细胞的恶性增殖失调导致肿瘤的发生。微小染色体维持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCM）参与了DNA复制起始的调控，MCM5是MCM家族成员之一，近年国外已有研究表明其可作为不典型增生和肿瘤的生物学标记物［1］。p16基因编码的p16蛋白为细胞周期的一种负性调节因子，可与细胞周期素D竞争结合细胞周期依赖性激酶(CDK4)，阻止细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。我们采用SP法免疫组化技术检测人肺腺癌组织中MCM5、p16蛋白的表达，比较其相关性及其与肺腺癌临床病理特征的关系，以探讨二者表达失常与人肺腺癌发生、发展的关系。

　　1  对象与方法

　　1.1  病例来源  　　

　　随机选取柳州市人民医院病理科2000年1月～2008年6月手术切除送检的肺腺癌病例材料60例。男42例，女18例；年龄36～79岁。肺腺癌的病理诊断、分级和TNM分类按2004年WHO肺肿瘤组织学分类标准进行。腺癌混合亚型30例，腺泡样腺癌18例，乳头状腺癌9例，细支气管肺泡癌3例。肺癌TNM分期分为Ⅰ期21例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例，Ⅳ期5例。其中伴有淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者24例。60例腺癌患者术前均未行放、化疗。另选取30例支肺脓肿、炎性假瘤及气管扩张症等炎性病变旁正常肺组织材料作为对照组。

　　1.2 试剂和方法  　　

　　标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片。免疫组织化学染色采用SP法，MCM5(CRCT51) 单克隆抗体购自Neo Markers公司，p16多克隆抗体和S-P试剂盒（Kit-9710）购自福州迈新生物技术公司。MCM5和p16切片均需作微波抗原修复，免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行。用已知MCM5、p16阳性肺癌和肺组织切片作阳性对照，以PBS取代一抗作阴性对照。

　　1.3 结果判断  　　

　　MCM5和p16蛋白检测以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性标志，染色阳性的判断参照Bukholm等［2］提出的标准：计数≥500个肿瘤细胞，以细胞核内出现棕黄色颗粒且阳性细胞数＜10%为（－），10%～30%为（＋），30%～70%为（＋＋），＞70%为（＋＋＋）。

　　1.4 统计学方法 

　　应用SPSS 10.0统计学软件对所得数据行χ2检验、秩和检验和Spearman等级相关分析。

　　2 结果

　　2.1 MCM5、p16蛋白在肺组织中的表达情况 

　　MCM5蛋白在肺腺癌组织中阳性表达呈棕黄色且定位于细胞核，灶状或弥漫性分布；而正常肺组织中仅在各级支气管上皮偶见个别或小灶状细胞核阳性表达，但阳性数<10%。p16在正常肺组织中表达于各级支气管上皮和肺泡上皮细胞核中；在肺腺癌组织中主要定位于癌细胞胞核，部分可见胞浆着色。MCM5蛋白在肺腺癌组中的阳性表达为100.00%，正常组中均为阴性表达；p16在腺癌组中（++）～（+++）阳性表达为20.00%（12/60），而正常组中（++）～（+++）阳性表达为100.00%（30/30）。经统计学处理，肺腺癌组中MCM5蛋白的阳性表达显著高于正常组（P＜0.01），而p16蛋白的阳性表达显著低于正常组（P＜0.01），见表1。表1  MCM5与p16蛋白在肺组织中的表达情况（略）

　　2.2 MCM5、p16蛋白的表达与肺腺癌临床病理特征的关系 

　　在肺腺癌组中MCM5、p16蛋白的阳性表达与组织学分级有关，MCM5蛋白的阳性表达在高分化组显著低于中分化组和低分化组（P＜0.01）；p16蛋白的阳性表达在高、中分化组均显著高于低分化组（P＜0.01）。淋巴结转移组中MCM5蛋白的阳性表达显著高于无淋巴结转移组（P＜0.05）；而p16的表达与淋巴结转移无关（P＞0.05）。MCM5和p16蛋白的表达均与肺腺癌的性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、TNM分期无关（P＞0.05），见表2。表2  肺腺癌组中MCM5与p16蛋白的表达与临床病理特征的关系（略）表3  肺腺癌组中MCM5、p16蛋白之间相互表达关系（略）

　　2.3 肺腺癌MCM5与p16表达的相互关系  　　

　　在p16（－）标本中MCM5（＋）者共17例，p16（＋）而MCM5（＋）者43例。经统计学处理，MCM5蛋白的阳性表达与p16的表达呈负相关（r=-0.4920，P<0.01）。

　　3 讨论

　　细胞周期调控异常是肿瘤发生的内在原因，在细胞周期中，G1/S的调控点是细胞内外信号经过传递、整合到细胞核，对细胞的增殖进行调控的关键点，它的异常与肿瘤的发生、发展关系密切［3］。细胞增殖调控异常与肿瘤的发生关系密切，而肿瘤细胞增殖活性与肿瘤生物学行为更是密切相关，是用于反映肿瘤良恶性及恶性程度的重要指征。MCM蛋白与细胞周期密切相关，是启动真核细胞DNA复制、调控细胞由G1期进入S期的关键蛋白，其本质是一种核蛋白复合物，目前发现MCM2～7等6种，它们是一组在序列上高度同源、功能上密切相关的蛋白，在静止/分化细胞中MCM蛋白不表达，而在增殖/肿瘤细胞中高表达，是近年来发现的一种较好地反映细胞增殖活性的新指标。大量研究表明［4，5］，MCM蛋白能够敏感而特异地反映细胞增殖的状况，是较Ki-67更为可靠的细胞增殖指标，在判断肿瘤的恶性度及评估预后方面有着较重要的意义。MCM5是MCM蛋白复合物之一，是一种与细胞增殖密切相关的因子，它的检测可直接反映MCM蛋白的表达水平［6］。Sirieix等［7］检测食管标本发现MCM5在食管癌中呈强阳性表达，而在大多数正常食管黏膜中为阴性，提示了MCM5能较好地反映肿瘤细胞的增殖特性，对肿瘤的诊断有一定意义。本实验中，MCM5蛋白在正常肺组织中无表达或仅在少数支气管上皮偶见个别或小灶状弱阳性表达，但细胞数＜10%，而在肺腺癌组织中则为全部阳性表达且（++）～（+++）表达为85.00%，肺腺癌组中MCM5蛋白的阳性表达显著高于正常组（P<0.01）。此外，肺腺癌组织中淋巴结转移组MCM5阳性率明显高于无淋巴结转移组（P＜0.05），且癌组中MCM5蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关，随着癌组织分化程度的降低，MCM5阳性率显著升高（P＜0.05）。提示组织分化程度越低，恶性程度越高，细胞增殖越旺盛，MCM5的阳性表达越强烈。表明MCM5的表达不仅反映了肺腺癌细胞的增殖活性，还与肿瘤的进展密切相关。MCM5蛋白阳性表达的肺腺癌细胞具有更强的侵袭、转移能力，而淋巴结转移是公认的肺癌预后不良的重要指标，因此，MCM5的表达对肺腺癌预后的判断具有重要的临床意义。

　　p16基因是一种肿瘤抑制因子又称多肿瘤抑制因子1（Multiple tumor suppressor，MTS1）或CDKN2基因，定位于人染色体9p21区域，编码16 000D的蛋白产物，是在细胞周期中起重要作用的CDK4（cyclin-dependent kinase 4）抑制物，它的缺失可增加CDK4的活性，导致Rb蛋白磷酸化，促进细胞从G1期向S期转变和细胞增殖，与非小细胞肺癌（NSCLC）及其它肿瘤发生、发展有密切相关。p16基因的缺失和突变在人类恶性肿瘤中普遍存在［8］。李代强等［9］在肺鳞癌癌前病变的研究中发现p16基因缺失在重度不典型性增生阶段即已有显著改变。本组中，肺腺癌组织中p16蛋白的阳性表达显著低于正常肺组织组(P<0.01)，高、中分化组中p16蛋白的阳性表达均显著低于低分化组（P<0.01)。说明p16蛋白的缺失或活性降低，丧失了针对G1/S期的“关卡”作用，从而失去了负调控能力，同时抑制了细胞的凋亡，促进了肺癌的发生。p16表达与肿瘤大小、组织学类型、TNM分期及淋巴结转移等无明显相关，提示p16基因改变是肺癌发生过程中的早期事件。因此可以认为p16基因改变是肺腺癌早期诊断的有用指标，p16蛋白表达缺失可提示肺腺癌发生的可能。
    　　
　　当MCM蛋白的表达调控异常导致MCM5蛋白高表达，同时存在着p16蛋白的低表达的状态下，DNA损伤的异常细胞绕过完整的细胞周期，可在S、G2、M期等处直接启动重复复制，有重复复制能力的细胞可逃逸细胞周期的多个限制点、避开细胞凋亡和DNA修复机制，导致异常复制和多倍体的形成，从而在细胞癌变的发生过程中起着关键的作用。癌组中MCM5与p16的表达呈显著性负相关（r=-0.4920，P<0.01），提示细胞复制准许因子MCM5调控异常和抑癌基因p16的低表达导致细胞的异常增殖可能涉及了人肺腺癌的发生过程。
    　　
　　对于肺腺癌组织，MCM5是一种较可靠的细胞增殖标记物，p16基因改变是肺癌发生过程中的早期事件，MCM5和p16蛋白的联合检测能弥补单个基因蛋白检测的不足，可对肿瘤进行早期诊断，且更准确地估测患者的预后，并提示双重蛋白异常在同一组织内的协同作用对于肿瘤的生物学行为有更重要的影响，还可作为评价肺腺癌癌细胞的增殖状态、预测肺腺癌临床预后、指导临床治疗的重要生物学指标。针对复制准许因子MCM功能的抑制，以阻断肿瘤细胞的增殖从而引起特异的癌性细胞灭活作用或许可作为一种新的抗癌靶目标。

【参考文献】
  　　［1］Freeman A, Morris LS, Mills AD, et al. Minichromosome maintenance proteins as biological markers of dysplasia and malignancy ［J］. Clin Cancer Res,1999,5(8):2121-2132.

　　［2］Bukholm JRK, Bukholm G, Holm R, et al. Association between histology grade, expression of Hs MCM2, and Cyclin A in human invasive breast carcinoma ［J］. J Clin Pathol，2003，56：368-373.

　　［3］McKay JA, Douglas JJ, Ross VG, et al. Analysis of key cell cycle checkpoint proteins in colorectal tumours ［J］. Journal of Pathology,2002,196(4):386-394.

　　［4］Rodins K, Cheale M, Coleman N, et al. Minichromosome maintenance protein expression in normal kidney and renal cell carcinomas:relationship to rumor dormancy and potential clinical utility ［J］. Clin Cancer Res,2002,8(4):1075-1081.

　　［5］Kato H, Miyazaki T, Fukai Y, et al. A new proliferation marker, minichromosome maintenance protein 2, is associated with tumor aggressiveness in esophageal squamous cell carcinoma ［J］. Surg Oncol,2003,84(1):24-30.

　　［6］Guida T, Salvatore G, Faviana P, et al. Mitogenic effects of the upregulation of minichromosome maintenance proteins in anaplastic thyroid carcinoma ［J］. J Clin Endocrinol Metab,2005,90(8):4703-4709.

　　［7］Sirieix PS, O’Donovan M, Brown J, et al. Surface expression of minichromosome maintenance proteins provides a novel method for detecting patients at risk for developing adenocarcinoma in Barrett’s esophagus ［J］. Clin Cancer Res,2003,9(7):2560-2566.

　　［8］Shao JC, Wu JF, Wang DB, et al. Relationship between the expression of human telomerase reverse transcriptase gene and cell cycle regulators in gastric cancer and its significance ［J］. World Journal of Gastroenterology,2003,9(3):427-431.

　　［9］李代强,谢季,李美蓉.肺鳞癌及癌前病变PCNA、P16、P21、P53表达及细胞凋亡观察［J］.临床与实验病理学杂志,2000,18(4):384-386.