继承和发扬相结合—中药青蒿的研究过程与启迪
【摘要】 青蒿素是由我国科学家于1970年从传统中药菊科植物黄花蒿中首次提取出的抗疟有效单体，此外，还开发了一系列衍生物、类似物等。青蒿素是从传统植物中提取得到药物的典范，深入透彻地学习和继承中药青蒿的发现及发展过程，对研究开发更多具有自主知识产权的产品和技术，加快中药现代化和产业化有重要的启迪作用。
【关键词】 青蒿 青蒿素 发现及发展
Abstract：Artemisinin was isolated from the traditional Chinese compositae plants Artemisia annua L. in the 1970s by Chinese scientists, which was an effective anti-malaria monmer, furthermore, derivatives of artemisinin and its analogue have been developed. Artemisinin set a good sample for using traditional medicine to provide new drugs, thoroughly study and inheritance the history of artemisinin discovery and development is important to our research products and technology that have more independent intellectual property rights, in order to improve the progress of modernization and industrialization of TCM.
Key wordsQinghao； Artemisinin； Discovery and development
中药青蒿为菊科草本植物黄花蒿Artemisia aanua L.的干燥地上部分。青蒿素（Arteannuin，结构式如图1）是我国发现的第一个植物化学药品，也是中国唯一被世界卫生组织认可的按合成药研究标准开发的中药。临床研究证明对氯喹敏感株疟、恶性疟及脑型疟有显著疗效，且可用于治疗对其它抗疟药有耐药性的病人。青蒿素的发现、发展以及临床上的应用，对医药化学的发展曾起了积极的推动作用。
1 青蒿素的发现及发展史
1.1 青蒿素的发现青蒿素的发现得益于传统中医药学，早在古代就有对青蒿研究的记载。青蒿载于《本草纲目》及马王堆出土的《五十二病方》。晋•葛洪《肘后备急方》《神农本草经》及《本草纲目》等医籍本草均有以复方青蒿汤、截疟青蒿丸、青蒿散及青蒿鳖甲汤等治疟记载。但中医药抗疟始终没有形成优势并在全球得以推广。
青蒿素结构式（略）
20世纪60年代疟疾大肆流行，疟原虫对王牌抗疟药氯喹产生抗药性，恶性疟成为世界性棘手难题。为此，以屠呦呦［1］为首的中国中医研究院的科学家于1969年通过有关防治疾病的古代文献和民间单方，结合实践经验，1971年发现中药青蒿乙醚提取的中性部分有显著的抗疟作用，1972年从青蒿中分离出活性物质—青蒿素，1973年经临床研究取得与实验一致的结果，抗疟新药青蒿素由此诞生。1976年周维善等经研究证明其为一种含有过氧基的新型倍半萜內酯。这项研究曾被国外专家誉为“20世纪后半叶最伟大的发明”。1985 年，青蒿素注射剂在临床实验中取得了良好的效果。1986年青蒿素获得一类新药证书，并获得“国家发明奖”。1.2 青蒿素类药物的发展史在研究青蒿素的构效关系中发现，青蒿素结构中的过氧基是产生抗疟作用的必需基团，内酯环的羰基还原成羟基时可增效，因此保留过氧键，经三类反应可得到多种衍生物，由此可得到如：蒿甲醚、蒿乙醚、蒿琥酯等衍生物。
目前比较成功的是广西桂林制药厂。1976年，广西桂林制药厂的总工程师刘旭［2］将C-12位羰基还原成醇羟基，变成双氢青蒿素，在此基础上合成了3个羧酸酯，3个磺酸酯和7个醚类化合物。经过筛选和临床实验发现，804衍生物青蒿琥酯(Artesunate)（以其实验室804命名）可解决水溶性的问题,且疗效提高5倍，具有速效、高效、低毒、多种给药途径、半衰期短等特点，是为抢救危重病人的生命而优先开发的，并获得了专利优秀奖（专利号：CN 851007813）。青蒿琥酯原料是在我国实行“新药审批办法”以来被卫生部批准的第一个一类新药，1987年发给了001号新药证书和生产批件，由桂林制药厂发明并独家生产［3，4］。WHO疟疾化疗科学工作组主席认为：“这一新的发现更重要的意义在于发现这种化合物独特的化学结构，它将为进一步设计合成新的药物指出方向。
除此之外，国内外的众多学者也对青蒿素进行了大量的研究，合成了许多衍生物及类似物，有许多抗疟活性超过青蒿素。李英等［5］以双氢青蒿素，在酸和碱的催化下与各种醇、羧酸酐和氯甲酸酯反应，合成其醚类，羧酸酯，碳酸酯类等衍生物47个，其中有12个抗疟活性超过青蒿素10倍。虞佩琳等［6］合成了42个侧链上带有卤素、氮或硫取代的化合物，多数化合物抗疟活性超过青蒿素，但并未超过相应的无杂原子取代的衍生物。而国外的学者对青蒿素类似物和简化物的合成做了相对较多的研究，包括：过氧化物［7］、臭氧化物［8］、1，2，4-三恶烷［7］、1，2，4，5-四恶烷［9］等，其中，Vennerstrom等［10］用酸催化的过氧化环己酮及其衍生物或臭氧化相应的环己酮甲氧基肟的方法合成了数十个四恶烷类化合物，其中水溶性臭氧化物（0OZ277）已进入临床试验，有望成为新一代抗疟药物。这几类化合物原料易得、易于合成、结构稳定，代表了新型抗疟药物的发展趋势，而其最终的作用机制、作用受体或靶点仍需要深入研究。同时，有些衍生物［11，12］除抗疟作用外，还具有其他显著的药理活性，这为深入研究青蒿素药理活性提供了一种新的思路。
2 青蒿素的化学研究
2.1 青蒿素的提取方法研究青蒿含有青蒿素、青蒿甲、乙、丙、丁、戊素，青蒿酸、蒿酸甲酯、青蒿醇［13］，其挥发油主要为蒿酮、异青蒿酮、枯敬醛、1，8-桉油精、丁香烯等［14］；还有香豆素、黄酮［15］，二氢青蒿酸过氧化物［16］等其它成分。其主要有效成分是青蒿素。
青蒿素的提取方法主要有：有机溶剂提取法［17］工艺简单，易于批量生产；然而由于经过长时间的提取和浓缩，易使过氧链破坏，收率降低，且易燃易爆，污染大，提取周期长。“丙酮-硅胶柱层析法”［18］在原料含量为0.1%时可采用，产品质量稳定，但提取工艺繁杂，大批量生产困难。稀乙醇法［19］工艺流程短、操作简便、成本低、安全，但收率仅在36%~40%；也有采用60%~70%乙醇，用CaO作为沉淀剂，得到青蒿素精品总收率大于0.4%［20］。近年来还有报道采用微薄辅助法（MAE）［21，22］、超临界流体萃取法（SFE）［23］、超声波提取法［24］，这些方法分离效能较佳、无残留溶剂，溶剂用量少；而所需设备条件比较高，不利于批量生产。由于其他的方法在工业化生产中仍存在不足，目前采用的较多的仍是有机溶剂法，通常采用120#汽油作为溶剂。
2.2 青蒿素的合成研究1979年，在测定结构的基础上开始了青蒿素合成的研究，1983年完成了青蒿酸经7步反应合成青蒿素的全过程［25］。1992年Acton和Roth对此进行了改进，缩短了反应历程，共有三步组成：①用NaBH4或NiCl氢化还原；②光氧化过程；③空气氧化过程，总收率可提高到32%［26］。而这一反应路线与植物的生物合成途径比较接近，可用来解释青蒿素在植物体内合成的可能机制，综合利用可以提高植物中青蒿素的含量。同时青蒿素的全合成也在1983年完成，Schmil等［27］首先报道以（-）-异薄勒醇为原料经13步反应完成，总产率为2.1%。目前已有多条途径，所不同的是所用原料的差异，如以R(+)-香草醛、胡薄荷醇、香茅醛、胡薄荷酮等原料进行青蒿素的全合成［28］。青蒿素的全合成在产量上虽高于人工栽培，但合成技术要求比较高，合成步骤多，总收率不高，而半合成收率相对来说比较高，比全合成在大批量生产上有应用前景。
随着基因工程、细胞工程、生物工程等的应用，利用植物组织培养来生产青蒿素或利用青蒿素前提生物合成青蒿素的技术，在大规模生产青蒿素的方面已显示出了很大的潜力。青蒿素生物合成有关的中间体有十几种，其中研究的比较多的是青蒿酸［29］和紫穗槐二烯［30］。而主要的组织培养体系包括：青蒿芽、青蒿毛状根、青蒿发根脓杆菌和生物反应器培养等，Souret FF小组［31］探索了雾化反应器、鼓泡反应器与流化床生物反应器对工业化青蒿毛状根基因表达的不同，为生物反应器的商业化应用提供了一定的依据。美国科学家最近成功地用转基因酵母合成了青蒿酸［32］。利用微生物合成，有望降低生产成本，但是目前还需要进一步的优化体系以及探索工业化大生产的条件。因此，在现有基础上，加强对青蒿素生物合成的研究，尽量采用合适的青蒿素中间体、温和的反应条件并减少合成步骤是今后研究的重点方向之一。
3 药理研究
目前，由于不同的学者所采用的实验模型和实验条件不同，对于青蒿素的抗疟机制并没有统一的解释。早期的超微结构研究表明，青蒿素主要作用于疟原虫的膜系结构［33］。两步学说认为［34］：与Fe2+的存在有重要关系，机体内铁能催化其过氧桥结构的分解,产生自由基,进而损伤虫体细胞膜结构达到抗疟目的。然而Parapini S等［35］研究认为Fe2+不存在时，仍具有抗疟活性。体外实验发现，血红素能催化青蒿素的还原分解，从而抑制了血红素的内化，阻断疟原虫对铁离子和蛋白质的利用［36］。还有学者提出是可能与抑制了疟原虫内质网钙ATP酶的活性有关［37］。也有些学者观察到青蒿素可能与疟原虫DNA分子相互作用，从而引起疟原虫的死亡［38，39］，而虫体DNA、疟蛋白是药物靶点的观点还需要更多的实验根据加以证实，不过现已成为研究者关注的新方向。
随着对青蒿素类药物药理作用研究的不断深入，已证实在抗疟、抗孕、免疫调节、抗心律失常和抗肿瘤等方面都有作用,其中抗肿瘤作用是目前研究的热点方向之一。1991年邓定安［40］首先报道了青蒿酸衍生物对小鼠白血病P388细胞有杀伤作用。后经实验证明，青蒿素及其衍生物对多种肿瘤细胞都有杀伤作用［41，42］，包括：黑色素瘤细胞，肾癌细胞，中枢神经系统肿瘤细胞，肺癌细胞，卵巢癌，乳腺癌，肝癌等，而且不同的衍生物对肿瘤细胞的作用强度不同，同一种衍生物对不同类型的肿瘤细胞作用强度也不同，具有较高的选择性。Efferth等［43］研究青蒿琥酯对55种人体肿瘤细胞的抗癌活性时发现，对白血病及结肠癌细胞最敏感，中度敏感的有黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统肿瘤及肾癌细胞等，非小细胞肺癌敏感性最差。其抗肿瘤作用机制是多方面的，主要包括：抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，通过自由基的产生及氧化应激直接杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤血管生成，逆转多药耐药，增加放化疗的敏感性等。目前青蒿素及其衍生物作为抗肿瘤药应用还需要解决很多方面的问题，如对肿瘤细胞作用的靶点、肿瘤蛋白的表达调控等需要深入研究；选择抗癌作用强、抗癌谱广的化合物；抗肿瘤活性的体内实验研究、临床应用研究等［44］。
4 展望
“中国医药学是一个伟大的宝库”。几十年来我国的合成药物多为仿制药，仅抗疟药——青蒿一例为我国发现的全新药物。尽管国外已有了组合化学，高通量筛选研制新药，而从我国国情看，青蒿的研究是中药研究方面比较著名的成功范例，并得到了全世界的公认。重温青蒿的研究历史，我们要在此基础上对其药理、化学成分、生物合成、类似物合成等方面进行充分挖掘、开发，为传统中药现代化开发提供指导性的典范作用，提高中药在世界上的地位，从而使传统中药走向产业化、现代化，充分发挥其经济效益和社会效益。
