91378$遗传病的基因治疗
摘要： 遗传病是指由于遗传物质改变所致的疾病。具有先天性、终生性和家族性。病种多、发病率高。目前已发现的遗传病超过3000种，估计每100个新生儿中约有3～10个患有各种程度不同的遗传病。本文就如何治疗遗传病提供途径。
关键词：遗传病；基因；治疗 ；途径
基因工程或称重组DNA技术是7O年代初发展起来的一门技术，由于它有广阔的理论和应用前景，进展极为迅速，现已广泛应用于药品、农业、工业各方面。在医学方面，基因治疗是人们极为关注的领域，因为人类的遗传疾病有2000种以上，但却没有有效的治疗方法。遗传疾病的根本原因是基因有了缺陷。基因治疗就是在机体中，将有缺陷的基因换上正常的基因，并使之适当表达，或者说，将正常基因插入机体中来纠正遗传缺陷。基因治疗可以分为两类，一是体细胞基因治疗，二是生殖细胞基因治疗。前者较易于进行，后者则关系到伦理问题，较为复杂。因此，目前的基因治疗研究，主要先从前者入手，而且先在动物身上进行试验。基因治疗的基本要求是；(1)首先在试验动物中证明所插入的基因能正确进入靶细胞中，并存留在该细胞中发挥作用；(2)表达的水平适当；(3)对细胞无损害。一般可供插入的DNA形式可以是DNA本身，可以是DNA与病毒基因片段相连接以利用病毒的复制信号，也可以将DNA包裹在膜状颗粒(如脂质体)，红细胞膜等并利用病毒复制信号。将DNA插入细胞中的方法有四种.
一、 以病毒为载体：
其中以一种RNA病毒，名逆转录病毒的应用较广，也有人试用DNA病
毒，如SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等。先将逆转录病毒的感染过程作一简单介绍。逆转录病毒(主要包括RNA、蛋白核心、糖蛋白外壳，包装顺序 )进入细胞后，进行逆转录，使病毒RNA转变为双链DNA，形成前病毒，然后整入宿主基因组(单拷贝，整入位置不定)。此时以前病毒作为模版，生成病毒蛋白及新的病毒RNA，二者结合产生新的病毒颗粒．从细胞中释放出来，再感染其他细胞。利用逆转录病毒为载体的试验步骤主要是先制备一个没有包装顺序 的缺陷型突变体，将此突变体引入只能产生空蛋白壳的细胞(称为包装缺陷细胞株时构建一个包含有重组基因及包装顺序 的表达载体，将之引入包装缺陷细胞株中，形成缺陷逆转录病毒生成细腿。在这些细胞中，含有人的重组基因的表达载体可包装入空蛋白壳中，产生缺陷逆转录病毒。此病毒可用于感染其他细胞，并使之产生重组人基因产物。可将含病毒的上清液，感染骨髓培养细胞，分离骨髓细胞，静脉注入经大量x一射线
照射骨髓的小鼠，检测插入基因的存在及表达。本方法的优点是感染率高，可达l00 ．可同时感染众多细胞，并可在单一位点．整入单一拷贝，虽然插入是随机的，但整合的DNA结构是清楚的。引入的病毒，对细胞不造成伤害 缺点是稳定性不够。在病毒复制时，产生顺序缺失，或引入的基因在复制过程中失去，或被前组，以致载体失效。
二、 化学法：
本法以磷酸钙介导DNA进入细胞。将DNA悬浮液加磷酸钙形成沉淀，铺在培养的细胞单层上。最佳结果在l 00—1 000细胞中有一个外源DNA 得到表达，一般在10-s～ l 0_。。且用于悬浮细胞(如骨髓细胞)培养，结果不好。此法的主要缺点是转染率不高。
三、 微注射法：
微注射法是用微细玻璃管将DNA注入受精卵中再送回体内，使之发育。微注射法在小鼠受精卵中使用较为成功，70 受注射的卵可发育成小鼠。转基因鼠的每一细胞都携带有注入的DNA，并传给后代。此种在其基因组中携带有外来基因的小鼠，名转基因小鼠。此法的优点是效率高，有1／s被注射的卵细胞转移成功，缺点是每次只能注射一个细胞。
四、 电转移法：
电转移是将培养细胞置于电场内，将外源基因导入细胞内的方法。当将细胞置于适宜的电场内，细胞膜出现瞬间微孔，可使外源物质进入细胞。此法可同时处理大量细胞，电转移后，部分细胞死亡，一部分存活。携带外源基因的细胞可在进一步培养中筛选出来。电转移可用于定位导入中的基因转移，更多地用于基因表达调控的研究。有多种因素影响插入基因的表达。引入的DNA大多数不能表达，能表达的是例外，引入的DNA的表达与启动子有关。使用逆转录病毒时，可利用其长末端重复(Long terminol repeat，LTR)转录信号，表达也与增强子有关，增强子能增强基因的表达，它有种属特异性，有些还可能有组织特异性。整入染色体的部位也很重要，插入的基因必需不致激活其下游的基因，如一些癌基因，不致破坏其他重要基因，也不致破坏调节顺序在基因治疗研究中面临的一个基本问题是从什么基因开始 为r寻找规律．宜选一些症状显著．治疗效果易于观察的遗传病，且缺陷在患者骨髓，因为这有易于引入及取出的优点，昂好缺陷物质系一种循环性蛋白质，如血液中的酶，它们的含量水平不需要准确调节 又基因属长期 1：启性的．这将有利于观察其凋节。符合上述要求的有三种遗传病，研究工作者选定它们为基因治疗的开始对象。一是次黄嘌鸣一鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(Hypoxanthine—quanine phosphoribosyl fransferase．HPRT)基因，铗乏此酶导致Lesch-Nyhan病，其主要症状是智力迟纯及自毁容貌 二是嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase，PNP)基因，缺乏此酶可导致严重免疫缺损症，三是腺核苷胱氨酶(Adenosine deaminase，ADA J基因，缺乏此酶可导致严重复合免疫缺损症。基因治疗在动物有过成功的经验。如有人曾将果蝇编码野生型红眼的酶基因经P因子导入白眼的缺陷型果蝇，使其眼恢复红色 又Hammer曾利用逆转录病毒为载体，对矮小种小鼠，插入生长激索基因，得到表达，使小鼠体重增加一倍半。在人类也有过尝试。1980年(?line曾对二例 地中海贫血患者，．导入 殊蛋白DNA．但追随观察四年之久，未观察到对患者有任何影响。当时时机尚未成熟．作者曾因此受到严重批评，并停止其研究资助我国已将地中海贫血及血友病作为遗传病基因治疗的主攻方向 我们试验室承担部分B一地中海贫血的基因治疗。我们构建了反转录病毒载体与 珠蛋白基因的重组体，将重组体DNA转移至包装细胞与鼠红白血病(MEL)细胞，在受体细胞内检测出 珠蛋白基因的整合与表达。本室又采用转珠蛋白基因小鼠方法研究了B一珠蛋白基因的表达调控，发现在c基因上游几个高敏位点中，高敏部位I是重要的增强子；又进一步发现高敏部位Ⅱ中的AP1位点是增强子作用的关键部位。含有增强子及 珠蛋白基因的反转录病毒载体在受体细胞中的表达检测在进行中。
为了克服整合的随机性，近年有人提出了基因打靶(Genetargeting)的方法，基因打靶是指利用基因转移方法，将外源DNA序列导八靶细胞后，通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组，将外源基因定点整合人靶细胞基因组上某一确定的位点，或对某一预先确定的靶位点进行定点突变的技术。但目前基因打靶的效率还很低，且靶细胞主要是胚胎干细胞，所形成的嵌台体涉及生殖系细胞 这些特点使得基因打靶能否用于人类遗传病的基因治疗成为值得深入探讨的问题。最近有报道说，科学工作者成功地在血管的特定部位直接引入遗传工程病毒，使病毒感染猪血管壁中的细胞，受感染的细胞几个月内生产该基因编码的蛋白质，产生局部疗效，而不
扩散到原治疗区之外。这为基因治疗开辟了局部治疗的新途径美国国立卫生研究院(NIH)和食品与药品管理局(FDA)经多年的酝酿，于1990年7月底批准了两起人的基因治疗。一起为一种恶性皮肤癌，另一起为ADA缺乏症 后者已有治疗的结果报道。受试者是一个4岁女孩子，因缺乏腺核苷胱氨酶(ADA)而患先天性免疫缺蹈综合症。给患儿输入含腺核苷胱氨酶基因的反转录病毒载体后，已可自身合成正常的ADA，免疫缺陷得到纠正。患该病的人全世界仅有20例，这种遗传病的基因治疗的成功不会给人类健康带来多大好处，但这是一个里程碑，是人类征服遗传病的漫长道路上的第一次胜利。它说明体细胞基因治疗遗传病是可行的。
