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CD146调控淋巴管生成的功能及机制研究，博士学位论文，共86页。
摘 要
淋巴管系统是与血管系统并行的体内物质运输系统，在维持组织液稳态，输送免疫细胞、参与免疫应答以及吸收膳食脂肪等过程中发挥重要作用。淋巴管生成与组织水肿、肿瘤转移、肥胖以及炎症性疾病密切相关。近年来，随着淋巴管标志物的发现，关于淋巴管生成的研究取得了突破进展，一些重要的淋巴管生成调控分子相继被鉴定出来。其中，血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor，VEGF-C）及其受体血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR-3）被认为是淋巴管生成关键调控分子，在调控淋巴管生成过程（出芽、增殖、迁移）中发挥重要作用。然而，有趣的是，VEGF-C缺失会阻断初始的淋巴管出芽进而抑制后续的淋巴管生成，而VEGFR3失活只会影响淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，对淋巴管的出芽没有影响。那么，VEGF-C是如何调控淋巴管的出芽的呢？这一直是本领域悬而未决的问题。
基于实验室前期研究发现敲低CD146造成斑马鱼严重的心脏瓣膜水肿，提示CD146参与淋巴管生成。本文通过生理和病理性淋巴管生成模型证实：VEGF-C通过CD146调控淋巴管的出芽并影响淋巴管的生成。CD146作为VEGF-C新型独立受体，当VEGF-C与CD146胞外端第四个Domain结合，促进CD146发生二聚，激活其胞内区第14-26位氨基酸，进而刺激p38信号活化，促进淋巴管出芽。CD146缺失或特异性抗体阻断抑制生理和病理的淋巴管生成。
本文创新点如下：
（1）证实CD146作为VEGF-C独立受体调控淋巴管出芽。证据如下：首先通过体外实验，利用CD146特异性siRNA和功能性抗体AA98，设计了免疫共沉淀，体外细胞功能以及相关生化实验，发现CD146与VEGF-C直接相互作用。并且CD146胞外第四个Domain对于VEGF-C的结合是十分重要的。细胞功能实验发现，不同于VEGFR3，CD146不仅能促进内皮细胞增殖、迁移、成管腔等功能，更重要的是能促进内皮细胞的出芽。然后，我们以斑马鱼为模型，利用特异性Morpholino分别敲低CD146和VEGF-C的表达，并对其进行实时追踪观察，结果发现与VEGF-C敲低表型相似，降低CD146表达抑制淋巴管内皮细胞出芽，阻碍淋巴管前体细胞线形成，最终导致胸导管缺失并严重的心脏瓣膜水肿。更重要的是，选择性过表达失活型CD146结果发现，CD146独立调控体内淋巴管生成，这一过程不依赖于血管生成。（2）首次发现CD146/VEGF-C通过激活p38信号促进内皮细胞的出芽。体外生化和细胞实验发现，VEGF-C不仅能激活Erk，Akt信号，还能刺激p38的活化。更重要的是，特异性信号阻断实验发现，CD146通过特异性激活p38信号促进内皮细胞的出芽。（3）揭示CD146/VEGF-C通路在淋巴管生成中的重要性，为肿瘤转移靶向治疗提供新依据。我们利用CD146全身敲除小鼠以及特异性功能抗体AA98，设计了异种移植瘤以及脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症模型，结果发现，CD146缺失或阻断会降低肿瘤以及炎症部位淋巴管的生成，减少免疫细胞的浸润。有意思的是，CD146缺失抑制哨前淋巴结中淋巴管的生成以及肿瘤远端转移但不会影响肿瘤体积的增长，提示我们在此过程中存在其他机制调控肿瘤的生长。
本研究的科学意义在于：回答了VEGF-C如何调控淋巴管出芽的问题，即不是VEGFR3/VEGF-C，而是CD146/VEGF-C通过激活p38信号促进淋巴管出芽进而影响后续淋巴管生成，为肿瘤转移靶向治疗提供新依据。
关键词：CD146，VEGF-C通路，淋巴管出芽，淋巴管生成，肿瘤转移，炎症

目 录
致 谢 I
摘 要 II
Abstract IV
目 录 VI
文献综述 1
1 淋巴管生成及调控机制 1
11 淋巴管系统概述 1
12 淋巴管生成时间轴 4
13 淋巴管生成调控机制 7
2 淋巴管生成与疾病 15
21 淋巴管与肿瘤转移 15
22 淋巴管与炎症性疾病 19
23 淋巴水肿 19
3 CD146的结构与功能 20
31 CD146的结构与表达 20
32 CD146的生物学功能 22
33 CD146相关的信号通路 24
研究内容 27
概 述 27
1 材料与方法 29
11 实验材料 29
12 实验方法 30
2 实验结果 41
21 VEGF-C上调淋巴管内皮上CD146表达 41
22 CD146参与VEGF-C促进的淋巴管内皮细胞的活化 42
23 CD146与VEGF-C直接相互作用 46
24 鉴定CD146与VEGF-C的相互作用位点 47
25 鉴定CD146胞内端的活化位点 49
26 CD146调控斑马鱼淋巴管出芽 50
27 CD146调控斑马鱼淋巴管生成 52
28 CD146调控淋巴管生成独立于血管生成 53
29 CD146缺失抑制肿瘤淋巴管生成 54
210 靶向CD146抗体治疗抑制肿瘤淋巴管转移 56
211 CD146缺失抑制炎症环境中淋巴管生成 57
3 小结与讨论 59
参考文献 62
作者简介及在读期间发表的学术论文与研究成果 75