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CD146在VEGF诱导的血管生成中的作用，博士学位论文，共88页。
摘 要
肿瘤血管生成是肿瘤发展和转移的重要步骤, 以肿瘤血管生成为靶标的治疗性药物受到越来越多的关注，目前抗肿瘤血管生成治疗的热点仍然是发现新的靶分子。2003年，我们实验室首次报道细胞粘附分子CD146是肿瘤新生血管标志分子，可能参与肿瘤血管生成。随后的系列研究表明：肿瘤微环境（如肝癌细胞条件培养上清）能够诱导CD146二聚化，进而引发p38/IKK/NF-кB信号通路活化，上调IL-8、ICAM-1和MMP-9等促血管生成因子的表达，进而促进血管生成。然而，无论是抗CD146单克隆抗体AA98，还是突变AA98的抗原表位（即点突变AA98识别所必需的半胱氨酸C452，C452是CD146二聚化的分子基础）都能够抑制肿瘤细胞条件培养上清所诱导的CD146二聚化，p38/IKK/NF-кB信号通路的活化及肿瘤血管生成。这些结果都表明CD146二聚化可能是其介导胞外信号传导的必要条件，CD146可能以膜受体形式参与信号传导和肿瘤血管生成。然而，我们并不知道是肿瘤细胞条件培养上清中的何种成分诱导CD146二聚化及下游信号传导。本论文的内容之一是探索CD146可能的功能性配体并研究其作用机制，这对于更深入地阐明CD146在肿瘤血管生成中的作用机制以及研发以CD146为靶点的肿瘤血管抑制剂具有十分重要的意义。
本论文发现肿瘤分泌物中重要的促血管生成因子VEGF能够促进CD146二聚化，进而激活NF-кB信号通路，促进血管生成。而破坏CD146二聚化所必需的分子基础（即点突变C452），可以明显的抑制VEGF诱导的NF-кB信号通路活化以及人脐静脉内皮细胞(HUVECs)形成血管样结构，这些数据表明CD146二聚化介导了VEGF诱导的信号传导及血管生成，CD146可能是VEGFR的共受体，对于VEGF诱导的下游信号传导起到重要的作用。进一步探索VEGF促进CD146二聚化的作用机制，我们发现VEGF是通过激活NADPH氧化酶4（内皮细胞活性氧的主要来源)，促进细胞产生活性氧，进而促进CD146二聚化的。然而，无论是抑制NADPH氧化酶的活性，或是抑制NADPH氧化酶亚基Rac1的活性，还是用siRNA抑制内源的NADPH氧化酶4表达，都可以明显阻断VEGF引发的CD146二聚化。这些结果表明NADPH氧化酶4在介导CD146二聚化过程中起到了重要作用。因此，本研究首次揭示了CD146二聚化在VEGF诱导血管生成中的作用，提示了CD146作为VEGFR共受体的可能性，并且指出了NADPH氧化酶4在CD146二聚化中的重要作用，对于寻找抗肿瘤血管生成治疗新靶标提供了新的思路。
本论文的第二部分工作是在建立可溶性CD146检测方法时，意外地发现磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性，并在此基础上拓展了磁性纳米颗粒的应用范围。早前的研究表明自身免疫病，如慢性肾衰、血管炎等患者血清中可溶性CD146过表达，可溶性CD146可能是某些疾病发生发展的标志分子，因此建立检测可溶性CD146的方法，在疾病的早期诊断或预后监测中具有重要的意义。我们在利用磁性纳米颗粒分离富集血清中可溶性CD146时，发现磁性纳米颗粒具有过氧化物酶(HRP)的催化活性，能够与HRP的不同底物反应产生不同的颜色；此外，与HRP相同，磁性纳米颗粒的催化活性也依赖于pH、温度和过氧化氢浓度，并且具有相同的催化机理，其所催化的反应具有专一、高效、快速等优点。这一发现的意义在于，发现磁性纳米颗粒可以作为HRP的模拟酶，拓展了磁性纳米的颗粒在环境检测，纳米医学等领域的应用。基于磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性，我们将其应用于不同领域：(1) 在环境监测领域：利用磁性纳米颗粒测定酸雨中过氧化氢含量，该方法与利用生物酶检测相比，具有成本低，稳定性好及可以反复回收利用等优点，对于优化环境监测方法具有重要意义；(2) 在免疫检测领域，由于磁性纳米颗粒的这种催化特性使其在免疫检测过程中容易导致高背景而降低检测灵敏度，我们通过封闭磁性纳米颗粒的这种催化特性建立了一种免疫检测方法，该方法实现了对于抗原的高灵敏度检测，检测灵敏度与传统的双抗夹心ELISA相比提高了五倍，检测时间缩短了三倍。通过切换不同检测探针，该方法可以实现对肿瘤标记物，病毒和生物毒素等多种样品的检测，对于疾病的诊断治疗以及生物安全都有重要的意义；(3) 在生物医学领域体内诊断方面，我们利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶活性，建立了一种体内示踪磁性纳米颗粒的新方法，该方法无需对磁性纳米颗粒进行预标记，即可以很好的评价其在体内的分布及代谢情况，该方法的建立对于了解磁性纳米颗粒的生物安全性具有重要意义。
关键词：CD146二聚化、肿瘤血管生成、VEGF、活性氧、NADPH氧化酶4、磁性纳米颗粒、模拟酶、环境监测、免疫检测、无标记示踪

目 录
中文摘要 ……1
英文摘要 ……3
目录 5
文献综述
第一部分 CD146与VEGF诱导血管生成机制…7
1 肿瘤血管生成机制 7
2 VEGF信号通路与肿瘤血管生成 ………10
3 NADPH氧化酶与血管生成 …14
4 CD146分子与肿瘤转移与血管生成中的作用 ……18
第二部分 纳米材料的生物学应用 …23
1 磁性纳米颗粒的生物学应用 23
研究内容
第一部分 CD146在VEGF诱导的血管生成中的作用……28
概述 ………28
1 材料与方法 ………29
2 实验结果 35
3 小结与讨论 ………45
第二部分 磁性纳米颗粒模拟酶的发现与应用 48
第一章 磁性纳米颗粒模拟酶在环境监测及免疫检测中的应用
概述 ………48
1 材料与方法 ………48
2 实验结果 49
3 小结与讨论 ………57
第二章 基于磁性纳米颗粒的生物传感器
概述 ………58
1 材料与方法 ………58
2 实验结果 60
3 小结与讨论 ………65
第三章 磁性纳米颗粒体内无标记示踪研究
概述 ………66
1 材料与方法 ………66
2 实验结果 67
3 小结与讨论 ………75
参考文献 …77
发表文章 …83
致谢 ………85