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HIV-1 gp41蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响，博士学位论文，共107页。
摘 要
人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）是全球广泛流行的艾滋病的致病因子。HIV-1病毒与宿主细胞的膜融合是其生命周期的起始步骤，对病毒侵染细胞起关键作用。膜融合过程由病毒的包膜蛋白（Envelope）介导完成，成熟的HIV-1包膜蛋白分为gp120和gp41两个亚基，其中gp41亚基直接诱导膜融合发生。尽管HIV-1病毒的变异性很强，但gp41亚基中跨膜区序列高度保守，被认为对膜融合过程有影响，但机制尚不清楚。跨膜区中一个引人注意的氨基酸是第696位带正电荷的精氨酸，由于带电荷的氨基酸很少出现在高度疏水的跨膜区，而且在HIV-1各分离株中该位点的唯一突变是同样带正电荷的赖氨酸，这暗示着该精氨酸残基可能对包膜蛋白执行功能起到重要作用。
为研究跨膜区精氨酸及周围氨基酸的作用，我们构建了一系列精氨酸替换突变体（Arg-substitution）和精氨酸轮转突变体（Arg-shifting），分别将精氨酸突变为其他氨基酸，以及改变精氨酸在跨膜区的位置，检测他们对包膜蛋白的影响。
结果表明，精氨酸替换突变体对包膜蛋白的合成、前体剪切和细胞膜上含量无明显影响；但不同电荷性质的氨基酸替换精氨酸会影响细胞膜融合。当精氨酸被替换为同样带正电荷的赖氨酸时，膜融合活性以及动力学曲线与野生型相似；替换为不带电荷的氨基酸时，膜融合活性降低；替换为带负电荷的氨基酸时，细胞融合被抑制，但保留部分诱发形成融合孔的能力。抑制实验进一步发现，可溶性CD4分子对负电荷氨基酸替换突变体介导的膜融合的抑制效应与野生型相似，而融合中间体抑制剂C34对负电荷氨基酸替换突变体介导的膜融合的抑制效应则比野生型有所延迟。这些结果提示，负电荷替换突变体不影响融合过程中的受体结合步骤，但影响了融合中间体的形成以及融合孔扩大等后续步骤。
我们进一步检测精氨酸在跨膜区不同位置以及在α螺旋上的相对朝向 (phase) 对包膜蛋白的影响，结果发现当精氨酸处于跨膜区第691~697位时，会导致包膜蛋白前体分子的剪切受损；当精氨酸处于跨膜区第698~701位时，虽然包膜蛋白的剪切正常，但只有当精氨酸出现在699和700位，即在α螺旋上与696位同侧时，才能保持细胞融合活性。此外，在跨膜区第691~698位引入额外的精氨酸会导致包膜蛋白更多的聚集在核周围区域，细胞膜上含量显著降低，当精氨酸处于α螺旋上与696位异侧时，这种影响更为明显。以上结果表明，精氨酸对包膜蛋白及膜融合的影响与其位置和朝向密切相关，只有当精氨酸位于跨膜区下半段（696下游）与696位同侧时，才能正常发挥其促进膜融合的作用。
综上所述，我们发现HIV-1包膜蛋白gp41亚基跨膜区内第696位精氨酸对包膜蛋白有重要作用。精氨酸通过位置和朝向相关的机制调节包膜蛋白的前体剪切、细胞内分布和细胞膜上含量，并促进膜融合的发生。由于膜融合过程对HIV-1病毒侵染细胞起关键作用，更好的理解特定氨基酸对膜融合的作用以及融合机制将为抑制病毒侵染提供更多解决方案。
关键词：HIV-1，包膜蛋白，gp41，跨膜区，精氨酸, 膜融合

目 录
摘 要I
AbstractIII
缩略词V
目 录VI
文献综述1
第一部分：HIV基因组、病毒蛋白和生命周期概述1
11 HIV病毒以及艾滋病1
12 HIV病毒结构、基因组以及病毒蛋白1
13 HIV的生命周期（复制周期）4
第二部分：HIV-1包膜蛋白的结构、功能以及其介导的膜融合机制7
21包膜蛋白概述7
22 Gp120的结构与功能8
23 Gp41的结构与功能9
24 包膜蛋白的其他功能11
25 包膜蛋白介导的膜融合过程11
第三部分：HIV gp41跨膜区的研究进展13
31 gp41跨膜区结构的研究进展14
32 gp41跨膜区功能的研究进展15
33跨膜区内带电荷氨基酸残基对蛋白功能的影响17
研究内容20
第一部分：HIV-1 gp41跨膜区精氨酸对细胞膜融合的影响20
前言20
11 材料与方法21
111 实验材料21
112 实验方法22
12 实验结果29
121 突变体构建29
122 精氨酸替换突变体不影响包膜蛋白的合成以及gp160前体剪切31
123 精氨酸替换突变体不影响包膜蛋白细胞膜表达32
124 精氨酸替换突变体影响了包膜蛋白介导的细胞融合35
125 精氨酸替换突变体影响了膜融合动力学42
126 负电荷氨基酸替换突变体仍保留部分融合孔形成能力44
127 负电荷氨基酸替换突变体影响了融合中间体的形成45
128 负电荷的氨基酸残基在跨膜区中未显示出负显性抑制46
129 多聚亮氨酸跨膜区回复突变体显示Gly694和Arg696对膜融合有重要作用47
13 总结与讨论49
131 总结gp41跨膜区第696位精氨酸残基对包膜蛋白的影响49
132 跨膜区带电荷氨基酸对膜蛋白的影响机制49
133 gp41跨膜区内精氨酸残基促进膜融合的机制50
VI
HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响
第二部分：HIV-1 gp41跨膜区精氨酸的位置和相对朝向对包膜蛋白的影响53
前言53
21 材料与方法54
211 实验材料54
212 实验方法54
22 实验结果57
221 HIV-1 gp41跨膜区采取α螺旋结构57
222 跨膜区内Gly694和Arg696的相对朝向影响gp160的剪切及膜融合57
223 精氨酸在特定朝向上对gp160剪切的影响是由其电荷性质引起的60
224 精氨酸在跨膜区上的位置也会影响gp160的剪切62
225 精氨酸处于跨膜区上半段时影响包膜蛋白的细胞内分布和细胞膜上表达65
226 跨膜区精氨酸在螺旋中的相对朝向影响包膜蛋白介导膜融合的能力74
23 总结与讨论76
231 总结精氨酸处于不同位置与朝向时对包膜蛋白的影响76
232 精氨酸通过位置和朝向相关方式影响包膜蛋白融合功能的机制77
参考文献81
已发表和待发表的文章97
致 谢99