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CD146在结直肠癌细胞干性及肿瘤发生中的功能及机制，博士学位论文，共100页。
摘 要
恶性肿瘤是当代医学面临的巨大挑战，严重威胁人类健康。肿瘤干细胞理论为肿瘤的耐药以及复发提供了合理的解释，同时也为癌症治疗提供了新的思路。然而，目前我们对于肿瘤细胞干性的认知仍不够全面。阐明与肿瘤干性相关的分子特征以及调控机制，一直是肿瘤领域的研究热点。细胞黏附分子CD146最初被鉴定于恶性黑色素瘤细胞上，主要参与血管新生及肿瘤转移。近年来，诸多报道提示，CD146作为间充质干细胞的表面标记物，可能与细胞多能性相关。也有少数研究发现，CD146表达于人类原发肉瘤及子宫肌瘤干/祖细胞亚群中。此外，实验室的前期工作还发现，CD146作为Wnt5a受体介导非经典Wnt信号传导，同时拮抗经典Wnt信号，从而促进细胞迁移和斑马鱼胚胎的集中延伸。经典Wnt通路与结直肠癌肿瘤发生有着密切关系，且在结直肠癌干细胞的自我更新中发挥关键作用。然而，对于CD146是否在肿瘤细胞干性及结直肠癌的发生中发挥功能尚不清楚。 针对上述科学问题，我们以结直肠癌为模型，采用慢病毒介导的shRNA干扰技术，敲低原代结直肠癌细胞系P6C以及结直肠癌细胞系SW480亚群上CD146表达，结合细胞全基因组表达谱分析及临床病理信息分析，首先探究了CD146对结直肠癌细胞致瘤性、干性分子表型及相关生物学行为的影响。连续异种移植成瘤实验结果表明，shRNA敲低CD146表达的结直肠肿瘤细胞，在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内形成肿瘤的潜伏期较短，肿瘤发生率更高。此外，肿瘤细胞上CD146表达水平与移植瘤及病人结直肠癌组织的恶性程度及分化水平呈负相关。体外细胞水平的研究显示，CD146敲低表达诱使结直肠癌肿瘤细胞上调表达干性相关转录因子及细胞表面标志物，如Sox-2、EpCAM等。更重要的是，敲低CD146表达的细胞在无血清悬浮培养中成球能力，以及在三维软琼脂培养体系中克隆形成能力增强，体现出干细胞的自我更新能力增强。同时，我们还发现，CD146敲低表达引起结直肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂 (L-OHP) 及5-氟尿嘧啶 (5-FU) 诱导的凋亡抵抗，进一步研究发现CD146低表达的细胞增殖相对缓慢，处于细胞周期S期的比例较少，且高表达膜转运蛋白ABCG2，这些结果表明，CD146敲低表达使得部分结直肠癌细胞进入静息期，对化疗药物的敏感性降低。为了进一步阐明上述现象的分子机理，我们通过多株结直肠癌细胞系及临床样本分析发现，肿瘤细胞膜上CD146的表达水平与Wnt/β-catenin活性以及致瘤性呈负相关。全基因组差异表达谱数据显示，CD146的下调导致一系列Wnt靶基因的转录激活及蛋白表达上调。进一步生物化学方法揭示，CD146下调表达能够抑制其下游NF-κB/p65信号的激活，进而减少p65依赖的GSK-3β转录及表达，从而抑制经典Wnt的效应因子β-catenin的降解，促进其转运入核并与TCF/LEF形成复合体，最终激活经典Wnt通路下游一系列干性相关靶基因的转录。总之，我们的研究表明，CD146敲低表达能够激活结直肠癌细胞经典Wnt/β-catenin信号，从而重塑干细胞样分子表型、自我更新、耐药性及肿瘤起始能力。此外，我们还发现CD146同时介导结直肠肿瘤细胞中非经典Wnt/JNK通路的激活，这一通路曾被报道促进细胞迁移和肿瘤转移，这提示我们CD146可能通过调节Wnt通路的不同分支，进而抑制结直肠癌的发生但促进其转移。本研究的创新点及科学意义在于：（1）首次发现CD146是结直肠癌细胞干性及肿瘤发生的负调控因子，并阐明了相关的分子机制，为干细胞的可塑性提供了新的证据，同时也为针对肿瘤干性的癌症靶向治疗策略提供了新思路；（2）揭示了黏附分子CD146在结直肠癌发生及转移过程中可能扮演的双重角色及相关作用机理，为以CD146为靶点的个性化药物开发以及肿瘤治疗提供参考与借鉴。
关键词: [CD146，肿瘤发生，细胞干性，Wnt信号通路，结直肠癌]

目 录
致谢 I
摘要 II
AbstractIV
目录 VI
文献综述1
1肿瘤细胞干性 1
1.1肿瘤研究历史与演进 1
1.2肿瘤干细胞的分子特征 5
1.3肿瘤干细胞的生物学特性 8
1.4肿瘤细胞干性的调控 15
1.5问题与展望 18
2CD146 与肿瘤发生发展 19
2.1 CD146分子结构及表达谱 19
2.2 CD146的生物学功能 21
2.3 CD146介导的信号通路 25
2.4问题与展望 27
研究内容29
概述29
1材料与方法 31
1.1实验材料 31
1.2实验方法 33
2实验结果 41
2.1建立及鉴定稳定敲低 CD146 表达的结直肠癌细胞株 41
2.2 CD146低表达促进结直肠癌肿瘤发生及恶性程度 42
2.3 CD146敲低表达诱导结直肠癌细胞再现干细胞表型 45
2.4 CD146敲低表达诱导结直肠癌细胞产生耐药性 47
2.5 CD146表达水平与结直肠癌细胞经典 Wnt 活性负相关 49
2.6 CD146抑制结直肠癌细胞经典 Wnt 活性 52
3小结与讨论 62
4后续研究 66
参考文献71
附录87
作者简介及在读期间发表的学术论文与研究成果89