硕士论文-农杆菌介导的Vf基因转化苹果的研究
- 资源类别：论文
- 资源分类：生物农医
- 适用专业：果树学
- 适用年级：大学
- 上传用户：bearcatzhang
- 文件格式：word
- 文件大小：534.75KB
- 上传时间：2011-8-16 23:41:53
- 下载次数：0 次
- 浏览次数：3 次
安全检测：瑞星：安全 诺顿：安全 卡巴：安全
资料简介
硕士论文-农杆菌介导的Vf基因转化苹果的研究，共72页，37004字
摘 要
苹果黑星病是世界上重要苹果产区的主要病害之一。目前，苹果抗黑星病育种的途
径，主要通过传统育种方法来获得抗性新品种，耗时较长，效率较低。利用植物转基因
技术，将受 CaMV 启动子调控的对黑星病具有抗性的 Vf 基因导入苹果当中，可获得对
黑星病具有高抗性的新品种，从而加快苹果抗黑星病育种的进程。
在本试验中，我们以三个苹果新品种“福早红”、“鲁加 3 号”和“鲁加 6 号”为材料，
通过对增殖条件、离体叶片再生条件、抗生素筛选条件、根癌农杆菌介导的遗传转化条
件等的研究和优化，建立了高频、稳定的再生和转化体系，并将 Vf 基因导入苹果“福早
红”当中。主要取得了以下研究结果：
1、确定了三个苹果的最佳增殖培养条件
研究表明，“福早红”、“鲁加 3 号”和“鲁加 6 号”三个苹果品种具有良好的增殖能力，
其增殖培养条件为：培养温度 25±2℃，光强 2000-3000Lx，光照时间 16h/d。最佳培养
基 激 素 配 比 分 别 为 ： BA1.00mg/L+NAA0.20mg/L 、 BA2.00mg/L+NAA 0.20mg/L 和
BA1.00mg/L+NAA0.05mg/L。
2、获得了“福早红”苹果离体叶片高效稳定的再生体系
通过分析基因型、激素组合、暗培养时间、硝酸银等对苹果离体叶片再生频率的影
响，确立了“福早红”苹果叶片高率再生体系：在含 BA4mg/L、NAA0.2mg/L 的改良 MS
培养基上，暗培养 15d 后转到光下培养可获得再生不定芽和再生植株，再生频率可达
91.67%。同时，研究不同 IAA 和 IBA 激素组合发现，以 1/2MS+IAA1.5mg/L+IBA1.0mg/L
为培养基，“福早红”苹果平均单根长较长，单株发根数较多，生根率较高，达 95%。
3、建立了“福早红”苹果高效转化体系，并得到了转化植株
通过对预培养时间、侵染时间、共培养时间、抑菌剂浓度、延迟培养时间等遗传转
化影响因素的研究，建立的苹果遗传转化体系为：叶片切伤后黑暗预培养 3d，经农杆菌
侵染 5min，在含 BA4mg/L、NAA0.2mg/L 的 MS 培养基上共培养 3d，然后加 200mg/LCef
延迟培养 4d，再加入 20mg/LKan 的选择压培养至抗性愈伤出现，转到光下进行 1-2 次
的继代筛选，获得抗性芽后，进行分株扩繁。
4、对转化植株进行了 PCR 检测
采用 CTAB 法提取转化植株的 DNA，利用人工合成引物进行 PCR 扩增。结果表明，
外源 Vf 基因已整合到“福早红”苹果基因组中。
关键词：苹果；农杆菌介导；Vf 基因；再生；遗传转化
目 录
中文摘要....... ... ... ... . …...Ⅰ
英文摘要....... ... ... ... .. …..Ⅱ
前言....... ... ... ..... ...... ...... . …….1
第一章
文献综述....... ... ... .. ……2
1 果树基因工程研究进展....... ... ... .... ……2
1.1 果树基因工程遗传转化方法....... ... ... ......... . …...2
1.1.1 农杆菌介导法....... ... ... ... .......... ……3
1.1.2 生物导入法....... ... ... ... .......... ... ……3
1.1.2.1 基因枪法....... ... ... ... ...... ...... . ……3
1.1.2.2 聚乙二醇法....... ... .. . .. ........... ……4
1.1.3DNA 直接摄取法....... ... ... ... ..... ……4
1.2 农杆菌介导基因转化的影响因素....... ... ... . . …...5
1.2.1 农杆菌的侵染能力及载体的影响....... ... . . ……5
1.2.2 农杆菌 vir 基因的活化....... ... ... . . ……5
1.2.3 受体基因型及外植体的不同....... ... ... ...... …….6
1.2.4 培养方法与培养条件....... ... ... . …….6
1.2.5 抗生素与选择压....... ... ... ... ..7
1.2.6 其他辅助处理....... ... ... ... ...... .. …….8
1.3 常见果树的转基因研究现状....... ... ... ........ ……..8
1.3.1 苹果....... ... ... ... ....... ….….8
1.3.2 梨....... ... ... ... ...... .... .…...10
1.3.3 桃....... ... ... ... .......... ......... ..10
1.3.4 葡萄....... ... ... ... .......... ....... . ..…... ..11
2 苹果黑星病及其抗性育种研究进展....... ... . …..11
2.1 苹果黑星病有关概况....... ... ... .... .…..11
2.2 寄主的抗病性....... ... ... ........... .......... ....12
2.2.1 单基因抗病性....... ... ... ... .... ............12
2.2.2 多基因抗病性....... ... ... ... ........ ....12
2.3 抗黑星病基因的分子标记....... ... ... ........ .......12
2.4 苹果黑星病抗性育种研究进展....... ... . .. ....13
第二章 苹果高频再生体系的建立....... ... . . .....15
1 材料与方法....... ... ... ... ......... ....... .....15
1.1 实验材料....... ... ... ... ......... ....... .... 15
1.1.1 植物材料 ....... ... ... ... ....... ..... ... 15
1.1.2 生化试剂....... ... ... ..... ....... ... ......15
1.2 方法....... ... ... ... ....... ....... ......... .. ..15
1.2.1 试材增殖培养基的筛选....... ... ... .......... ......15
1.2.2 苹果叶片再生培养基的筛选及影响因素的探讨....... . ...... ...16
1.2.2.1 基因型....... ... ... ... ......... ...... .....16
1.2.2.2 激素浓度及配比....... ... ... ... ......16
1.2.2.3 暗培养时间....... ... ... ....... ......... ....... ….... 17
1.2.2.4 硝酸银 （AgNO3）....... ... ............ ..... 17
1.2.3 生根培养基的确定....... ... . .....18
1.2.4 玻璃化苗恢复试验....... ... ......18
1.2.4.1 降低激素浓度....... ... ... .... . ......19
1.2.4.2 暗培养处理....... ... ... .... ...... .....19
2 结果与分析....... ... ... .... ....... ....... .... 19
2.1 继代培养基的筛选....... ... ... .... . ....19
2.2 叶片再生不定芽生长状态观察....... ... ......... ... .......... ......... ...... 20
2.3 苹果叶片再生培养基的筛选及影响因素的探讨...... ...... ...... ...... ...... ...... ...... ....... ...... ...... ..20
2.3.1 基因型...... ..... ...... ...... ...... ...... ...... .. ... ......20
2.3.2 激素浓度及配比....... ... ... .... ...... 21
2.3.3 暗培养时间对“福早红”苹果再生频率的影响....... .23
2.3.4 硝酸银对“福早红”离体叶片再生不定芽的影响....... .........23
2.4“福早红”生根培养基的确定....... ... ........... 24
2.5 玻璃化组培苗恢复试验....... ... ........... ... ....25
2.5.1 降低激素浓度....... ... ... ... ....... .. .25
2.5.2 暗培养处理....... ... ... ... ....... ....... 26
3 讨论....... ... ... ... ....... ....... ....... ....... ..26
3.1 影响苹果试管苗叶片再生的因素....... ... ... ... 26
3.1.1 基因型....... ... ... ... ....... ....... ....... 27
3.1.2 激素....... ... ... ... ....... . ... ......... ....27
3.1.3 前期暗处理....... ... ... ... ....... ..... ..27
3.1.4 硝酸银....... ... ... .. ....... ....... ...... .28
3.2 苹果叶片再生的途径....... ... ... ... ...28
3.3 试管苗的玻璃化问题....... ... ... ... ...29
第三章 Vf 基因导入“福早红”苹果的研究....... ... ............30
1 材料与方法....... ... ... ... ....... ....... ..... 30
1.1 材料....... ... ... ... ....... ....... ....... .......30
1.1.1 植物材料....... ... ... ... ....... ....... ....30
1.1.2 菌株....... ... ... ... ....... ....... ....... ....30
1.1.3 培养基与培养液....... ... ... ... ........30
1.2 方法....... ... ... ... ....... ....... ....... . .....30
1.2.1 卡那霉素（Kan）敏感性试验....... ... ... .. ...30
1.2.1.1 选择压的确定....... ... ... ... . ...... 31
1.2.1.2 生根过程中 Kan 浓度的确定....... ... ... .... 31
1.2.2 最佳抑菌抗生素（Cef）浓度的确定....... ... ............31
1.2.3 最佳侵染时间的确定....... ... ... . ..... 31
1.2.4 最佳共培养时间的确定....... ... ... ... 31
1.2.5 最佳延迟培养天数的确定....... ... ... ............ 31
1.2.6 转基因植株的 PCR 扩增鉴定....... ... ...... 31
1.2.6.1 试管苗 DNA 的提取（CTAB 法）... ... ... ....31
1.2.6.2 质粒 DNA 的提取（碱裂解法）... ... ......32
1.2.6.3 转基因植株的 PCR 检测....... ... ..... .....33
1.2.6.4 电泳检测....... ... ... ... ......... .. ....34
2 结果与分析....... ... ... ... ....... ...... ....34
2.1 卡那霉素（Kan）的敏感性试验....... ... . .....34
2.1.1 选择压的确定....... ... ... ... ..... ....34
2.1.2 卡那霉素对生根的影响....... ... ....... ... ...35
2.2 最佳抑菌抗生素（Cef）的确定....... ... ... .....36
2.3 最佳侵染时间的确定....... ... ... .. ...37
2.4 最佳共培养时间的确定....... ... ... .. ...37
2.5 最佳延迟培养天数的确定....... ... ... ........... ...38
3 转化程序的优化....... ... ... ... ....... . ...39
3.1 叶片预培养....... ... ... ... ....... ...... ...39
3.2 农杆菌的活化....... ... ... ... ....... ... ..40
3.3 侵染....... ... ... ... ....... ....... ...... ..... .40
3.4 黑暗共培养....... ... ... ... ....... . ........40
3.5 延迟筛选....... ... ... ... ....... ..... ...... .40
3.6 选择培养....... ... ... ... ....... ..... ...... .40
3.7 抗性植株的获得....... ... ... ... .. .......40
4 转基因植株的 PCR 扩增鉴定....... ... ... .... .......41
5 讨论....... ... ... ... ....... ....... ....... ..... ...42
5.1 转化效率的影响因素....... ... ... . ....42
5.2 选择策略....... ... ... ... ....... ....... .... .42
结论....... ... ... ... ....... ....... ....... ....... .. .44
致谢...... ... ... ... ....... ....... ....... ....... .. ..45
参考文献....... ... ... ... ....... ....... ....... ........46
附录Ⅰ....... ... ... ... ....... ....... ....... ..... .... .51
附录Ⅱ....... ... ... ... ....... . ...... .... ...... …...52
附录Ⅲ...... ... . ... ....... . .......54
导师组意见...... ... . ... ....... ..55
学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书............ ............ .56
摘 要
苹果黑星病是世界上重要苹果产区的主要病害之一。目前，苹果抗黑星病育种的途
径，主要通过传统育种方法来获得抗性新品种，耗时较长，效率较低。利用植物转基因
技术，将受 CaMV 启动子调控的对黑星病具有抗性的 Vf 基因导入苹果当中，可获得对
黑星病具有高抗性的新品种，从而加快苹果抗黑星病育种的进程。
在本试验中，我们以三个苹果新品种“福早红”、“鲁加 3 号”和“鲁加 6 号”为材料，
通过对增殖条件、离体叶片再生条件、抗生素筛选条件、根癌农杆菌介导的遗传转化条
件等的研究和优化，建立了高频、稳定的再生和转化体系，并将 Vf 基因导入苹果“福早
红”当中。主要取得了以下研究结果：
1、确定了三个苹果的最佳增殖培养条件
研究表明，“福早红”、“鲁加 3 号”和“鲁加 6 号”三个苹果品种具有良好的增殖能力，
其增殖培养条件为：培养温度 25±2℃，光强 2000-3000Lx，光照时间 16h/d。最佳培养
基 激 素 配 比 分 别 为 ： BA1.00mg/L+NAA0.20mg/L 、 BA2.00mg/L+NAA 0.20mg/L 和
BA1.00mg/L+NAA0.05mg/L。
2、获得了“福早红”苹果离体叶片高效稳定的再生体系
通过分析基因型、激素组合、暗培养时间、硝酸银等对苹果离体叶片再生频率的影
响，确立了“福早红”苹果叶片高率再生体系：在含 BA4mg/L、NAA0.2mg/L 的改良 MS
培养基上，暗培养 15d 后转到光下培养可获得再生不定芽和再生植株，再生频率可达
91.67%。同时，研究不同 IAA 和 IBA 激素组合发现，以 1/2MS+IAA1.5mg/L+IBA1.0mg/L
为培养基，“福早红”苹果平均单根长较长，单株发根数较多，生根率较高，达 95%。
3、建立了“福早红”苹果高效转化体系，并得到了转化植株
通过对预培养时间、侵染时间、共培养时间、抑菌剂浓度、延迟培养时间等遗传转
化影响因素的研究，建立的苹果遗传转化体系为：叶片切伤后黑暗预培养 3d，经农杆菌
侵染 5min，在含 BA4mg/L、NAA0.2mg/L 的 MS 培养基上共培养 3d，然后加 200mg/LCef
延迟培养 4d，再加入 20mg/LKan 的选择压培养至抗性愈伤出现，转到光下进行 1-2 次
的继代筛选，获得抗性芽后，进行分株扩繁。
4、对转化植株进行了 PCR 检测
采用 CTAB 法提取转化植株的 DNA，利用人工合成引物进行 PCR 扩增。结果表明，
外源 Vf 基因已整合到“福早红”苹果基因组中。
关键词：苹果；农杆菌介导；Vf 基因；再生；遗传转化
目 录
中文摘要....... ... ... ... . …...Ⅰ
英文摘要....... ... ... ... .. …..Ⅱ
前言....... ... ... ..... ...... ...... . …….1
第一章
文献综述....... ... ... .. ……2
1 果树基因工程研究进展....... ... ... .... ……2
1.1 果树基因工程遗传转化方法....... ... ... ......... . …...2
1.1.1 农杆菌介导法....... ... ... ... .......... ……3
1.1.2 生物导入法....... ... ... ... .......... ... ……3
1.1.2.1 基因枪法....... ... ... ... ...... ...... . ……3
1.1.2.2 聚乙二醇法....... ... .. . .. ........... ……4
1.1.3DNA 直接摄取法....... ... ... ... ..... ……4
1.2 农杆菌介导基因转化的影响因素....... ... ... . . …...5
1.2.1 农杆菌的侵染能力及载体的影响....... ... . . ……5
1.2.2 农杆菌 vir 基因的活化....... ... ... . . ……5
1.2.3 受体基因型及外植体的不同....... ... ... ...... …….6
1.2.4 培养方法与培养条件....... ... ... . …….6
1.2.5 抗生素与选择压....... ... ... ... ..7
1.2.6 其他辅助处理....... ... ... ... ...... .. …….8
1.3 常见果树的转基因研究现状....... ... ... ........ ……..8
1.3.1 苹果....... ... ... ... ....... ….….8
1.3.2 梨....... ... ... ... ...... .... .…...10
1.3.3 桃....... ... ... ... .......... ......... ..10
1.3.4 葡萄....... ... ... ... .......... ....... . ..…... ..11
2 苹果黑星病及其抗性育种研究进展....... ... . …..11
2.1 苹果黑星病有关概况....... ... ... .... .…..11
2.2 寄主的抗病性....... ... ... ........... .......... ....12
2.2.1 单基因抗病性....... ... ... ... .... ............12
2.2.2 多基因抗病性....... ... ... ... ........ ....12
2.3 抗黑星病基因的分子标记....... ... ... ........ .......12
2.4 苹果黑星病抗性育种研究进展....... ... . .. ....13
第二章 苹果高频再生体系的建立....... ... . . .....15
1 材料与方法....... ... ... ... ......... ....... .....15
1.1 实验材料....... ... ... ... ......... ....... .... 15
1.1.1 植物材料 ....... ... ... ... ....... ..... ... 15
1.1.2 生化试剂....... ... ... ..... ....... ... ......15
1.2 方法....... ... ... ... ....... ....... ......... .. ..15
1.2.1 试材增殖培养基的筛选....... ... ... .......... ......15
1.2.2 苹果叶片再生培养基的筛选及影响因素的探讨....... . ...... ...16
1.2.2.1 基因型....... ... ... ... ......... ...... .....16
1.2.2.2 激素浓度及配比....... ... ... ... ......16
1.2.2.3 暗培养时间....... ... ... ....... ......... ....... ….... 17
1.2.2.4 硝酸银 （AgNO3）....... ... ............ ..... 17
1.2.3 生根培养基的确定....... ... . .....18
1.2.4 玻璃化苗恢复试验....... ... ......18
1.2.4.1 降低激素浓度....... ... ... .... . ......19
1.2.4.2 暗培养处理....... ... ... .... ...... .....19
2 结果与分析....... ... ... .... ....... ....... .... 19
2.1 继代培养基的筛选....... ... ... .... . ....19
2.2 叶片再生不定芽生长状态观察....... ... ......... ... .......... ......... ...... 20
2.3 苹果叶片再生培养基的筛选及影响因素的探讨...... ...... ...... ...... ...... ...... ...... ....... ...... ...... ..20
2.3.1 基因型...... ..... ...... ...... ...... ...... ...... .. ... ......20
2.3.2 激素浓度及配比....... ... ... .... ...... 21
2.3.3 暗培养时间对“福早红”苹果再生频率的影响....... .23
2.3.4 硝酸银对“福早红”离体叶片再生不定芽的影响....... .........23
2.4“福早红”生根培养基的确定....... ... ........... 24
2.5 玻璃化组培苗恢复试验....... ... ........... ... ....25
2.5.1 降低激素浓度....... ... ... ... ....... .. .25
2.5.2 暗培养处理....... ... ... ... ....... ....... 26
3 讨论....... ... ... ... ....... ....... ....... ....... ..26
3.1 影响苹果试管苗叶片再生的因素....... ... ... ... 26
3.1.1 基因型....... ... ... ... ....... ....... ....... 27
3.1.2 激素....... ... ... ... ....... . ... ......... ....27
3.1.3 前期暗处理....... ... ... ... ....... ..... ..27
3.1.4 硝酸银....... ... ... .. ....... ....... ...... .28
3.2 苹果叶片再生的途径....... ... ... ... ...28
3.3 试管苗的玻璃化问题....... ... ... ... ...29
第三章 Vf 基因导入“福早红”苹果的研究....... ... ............30
1 材料与方法....... ... ... ... ....... ....... ..... 30
1.1 材料....... ... ... ... ....... ....... ....... .......30
1.1.1 植物材料....... ... ... ... ....... ....... ....30
1.1.2 菌株....... ... ... ... ....... ....... ....... ....30
1.1.3 培养基与培养液....... ... ... ... ........30
1.2 方法....... ... ... ... ....... ....... ....... . .....30
1.2.1 卡那霉素（Kan）敏感性试验....... ... ... .. ...30
1.2.1.1 选择压的确定....... ... ... ... . ...... 31
1.2.1.2 生根过程中 Kan 浓度的确定....... ... ... .... 31
1.2.2 最佳抑菌抗生素（Cef）浓度的确定....... ... ............31
1.2.3 最佳侵染时间的确定....... ... ... . ..... 31
1.2.4 最佳共培养时间的确定....... ... ... ... 31
1.2.5 最佳延迟培养天数的确定....... ... ... ............ 31
1.2.6 转基因植株的 PCR 扩增鉴定....... ... ...... 31
1.2.6.1 试管苗 DNA 的提取（CTAB 法）... ... ... ....31
1.2.6.2 质粒 DNA 的提取（碱裂解法）... ... ......32
1.2.6.3 转基因植株的 PCR 检测....... ... ..... .....33
1.2.6.4 电泳检测....... ... ... ... ......... .. ....34
2 结果与分析....... ... ... ... ....... ...... ....34
2.1 卡那霉素（Kan）的敏感性试验....... ... . .....34
2.1.1 选择压的确定....... ... ... ... ..... ....34
2.1.2 卡那霉素对生根的影响....... ... ....... ... ...35
2.2 最佳抑菌抗生素（Cef）的确定....... ... ... .....36
2.3 最佳侵染时间的确定....... ... ... .. ...37
2.4 最佳共培养时间的确定....... ... ... .. ...37
2.5 最佳延迟培养天数的确定....... ... ... ........... ...38
3 转化程序的优化....... ... ... ... ....... . ...39
3.1 叶片预培养....... ... ... ... ....... ...... ...39
3.2 农杆菌的活化....... ... ... ... ....... ... ..40
3.3 侵染....... ... ... ... ....... ....... ...... ..... .40
3.4 黑暗共培养....... ... ... ... ....... . ........40
3.5 延迟筛选....... ... ... ... ....... ..... ...... .40
3.6 选择培养....... ... ... ... ....... ..... ...... .40
3.7 抗性植株的获得....... ... ... ... .. .......40
4 转基因植株的 PCR 扩增鉴定....... ... ... .... .......41
5 讨论....... ... ... ... ....... ....... ....... ..... ...42
5.1 转化效率的影响因素....... ... ... . ....42
5.2 选择策略....... ... ... ... ....... ....... .... .42
结论....... ... ... ... ....... ....... ....... ....... .. .44
致谢...... ... ... ... ....... ....... ....... ....... .. ..45
参考文献....... ... ... ... ....... ....... ....... ........46
附录Ⅰ....... ... ... ... ....... ....... ....... ..... .... .51
附录Ⅱ....... ... ... ... ....... . ...... .... ...... …...52
附录Ⅲ...... ... . ... ....... . .......54
导师组意见...... ... . ... ....... ..55
学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书............ ............ .56
资料文件预览
共1文件夹，1个文件，文件总大小：1.66MB，压缩后大小：534.75KB
- 硕士论文-农杆菌介导的Vf基因转化苹果的研究
硕士论文-农杆菌介导的Vf基因转化苹果的研究.doc [1.66MB]
下载地址
- [ 硕士论文-农杆菌介导的Vf基因转化苹果的研究下载 ] （需要: 90 个学海币） 如何赚学海币
资料评论
注意事项
下载FAQ:
Q: 为什么我下载的文件打不开？
A: 本站所有资源如无特殊说明，解压密码都是www.xuehai.net，如果无法解压，请下载最新的WinRAR软件。
Q: 我的学海币不多了，如何获取学海币？
A: 上传优质资源可以获取学海币，详细见学海币规则。
Q: 为什么我下载不了,但学海币却被扣了？
A: 由于下载人数众多，下载服务器做了并发的限制。请稍后再试，48小时内多次下载不会重复扣学海币。
下载本文件意味着您已经同意遵守以下协议
1. 文件的所有权益归上传用户所有。
2. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
3. 学海网仅提供交流平台，并不能对任何下载内容负责。
4. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
5. 本站不保证提供的下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
Q: 为什么我下载的文件打不开？
A: 本站所有资源如无特殊说明，解压密码都是www.xuehai.net，如果无法解压，请下载最新的WinRAR软件。
Q: 我的学海币不多了，如何获取学海币？
A: 上传优质资源可以获取学海币，详细见学海币规则。
Q: 为什么我下载不了,但学海币却被扣了？
A: 由于下载人数众多，下载服务器做了并发的限制。请稍后再试，48小时内多次下载不会重复扣学海币。
下载本文件意味着您已经同意遵守以下协议
1. 文件的所有权益归上传用户所有。
2. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
3. 学海网仅提供交流平台，并不能对任何下载内容负责。
4. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
5. 本站不保证提供的下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
