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硕士论文-小鼠和家兔卵母细胞体外发生的培养体系与发育特征的研究，共57页，35874字
摘要
哺乳动物卵巢卵母细胞发育的研究，最初主要关注生殖细胞形成的早期阶段或出生
后卵泡的生长发育。然而，至今为止，对原始卵泡的形成以及卵泡生长的启动与选择的
调控机制还了解很少。虽然小鼠原始卵泡可以体外培养发育并可获得成熟的卵母细胞，
但减数分裂前的雌性生殖细胞不能在体外完成这一过程。鉴于此，本试验以家兔和小鼠
为模型动物，来筛选一种简便、易行的卵巢卵母细胞体外发生的培养体系，进行卵母细
胞的体外发生研究。
本研究分析了在完全体外条件下，小鼠卵巢卵母细胞的分化与发育能力。机械法分
离 12.5 dpc 胎鼠卵巢，并将胎鼠卵巢去除中肾组织后贴壁培养 28 d，分析小鼠卵母细胞
体外发生与卵巢卵母细胞体内正常发育之间的差异，研究结果发现，小鼠减数分裂前的
雌性生殖细胞体外培养可发育成平均直径为 75 μm 左右的卵母细胞，培养 2 d 后，卵巢
组织开始贴壁，第 10 d，卵母细胞形态开始出现，第 26 d 时，卵母细胞平均直径增大到
70 μm 以上，体外培养最后得到的卵母细胞平均直径可以达到 75 μm，而体内正常发育
的卵泡平均直径能达到 84.7 μm，两者差异显著(P<0.05)。另外，体外培养了 22 d 的卵
巢卵泡直径可达到 90 μm 以上，颗粒细胞 1.6±0.2 层，细胞数目为 32±2.6 个，与体内发
育的卵泡相比差异显著(P<0.05)，但体外发育的卵母细胞的特异基因表达与正常小鼠的
没有显著差异。此外，体外培养的卵母细胞不能完成减数分裂，因为只有体内发育成熟
的卵母细胞有 pERK1/2 表达，而体外培养的卵母细胞不表达。
本研究根据家兔卵巢卵母细胞的体内发育特征初步探讨了家兔卵巢卵母细胞体外
发育的培养体系。采集 30 日龄家兔卵巢在不同培养条件下长期培养，分析家兔卵母细
胞的体外发生与家兔卵巢卵母细胞体内正常发育之间的差异，来优化家兔卵巢卵母细胞
的体外培养体系。本试验从基础培养液、FSH 浓度、BSA/血清等方面来筛选较好的培
养条件，结果表明：使用 DMEM/F12+α-MEM 为基础培养液培养的卵巢的卵母细胞数最
多(17.4±3.5 个/卵巢)，直径最大(63 ± 3.2 μm)，与其它组相比差异显著(P<0.05)；添加血
清的培养液培养的卵巢的卵母细胞数(16.7±2.9 个/卵巢)与卵母细胞直径(60.2±3.3 μm)比
添加 BSA 的培养液效果好，差异显著(P<0.05)；家兔卵巢组织在 FSH 浓度为 50 mIU/ml
的培养液中生长较好，卵母细胞数量多(18.5±2.8 个/卵巢)，直径较大(65±2.3 μm)，与其
他组相比，差异显著(P<0.05)。新生兔卵巢组织在 DMEM/F12 +α-MEM 和 10% FCS 培
养液培养到 28 d 时，卵母细胞直径平均可达到 56±2.3 μm，每个卵巢组织上的卵母细胞
数量平均为 16±3.6 个。
关键词：小鼠; 家兔; 卵巢; 卵母细胞; 体外培养
目录
摘要..... 1
ABSTRACT.............. 3
前言..... 1
第一部分 哺乳动物卵巢卵母细胞异位发育 3
1 卵巢组织的同种移植 ............. 3
1.1 卵巢组织的自体移植............ 4
1.2 卵巢组织的同种异体移植.... 4
1.2.1 卵巢组织的同种同位发育. 4
1.2.2 卵巢组织的同种异位发育. 5
2 卵巢组织的异种移植 ............. 6
2.1 新鲜卵巢组织的异种异位发育............... 6
2.2 冷冻卵巢组织的异种异位发育............... 7
3 卵巢组织移植早期卵泡卵母细胞的发育与凋亡 ......... 9
4 异位发育在移植医学应用研究中存在的问题 ........... 10
5 结语 ... 11
第二部分 小鼠胎儿卵巢卵母细胞的体外发生............. 12
1 材料与方法 .......... 13
1.1 材料 13
1.1.1 试验动物...... 13
1.1.2 试验仪器...... 13
1.1.3 试验试剂...... 14
1.2 方法 14
1.2.1 胎鼠生殖嵴的分离......... 14
1.2.2 胎儿卵巢的体外培养..... 14
1.2.3 卵母细胞直径测量......... 14
1.2.4 卵泡发育阶段特异基因检测的表达 14
1.2.5 卵母细胞蛋白因子的 Western blot 分析........... 16
2 结果与分析 .......... 16
2.1 胎儿卵巢的体外发育.......... 16
2.2 卵泡发育阶段特异基因的表达检测..... 18
2.3 Western blot 分析................ 19
3 讨论 ... 20
3.1 卵母细胞的体外发生及其影响因素..... 20
3.2 卵母细胞与颗粒细胞的互作................. 21
3.3 卵泡卵母细胞发育中的特异基因表达. 22
第三部分 家兔卵巢卵母细胞体外发育的.. 24
1. 材料与方法 ......... 25
1.1 材料................. 25
1.1.1 试验动物...... 25
1.1.2 试验试剂...... 25
1.2方法................. 25
1.2.1 兔卵巢组织的获取......... 25
1.2.2 30 日龄家兔卵巢组织的体外培养... 25
1.2.3 新生家兔卵巢组织的体外培养........ 26
1.2.4 卵巢组织切片................. 26
1.2.5 卵泡发育阶段测定与卵母细胞直径测量........... 27
1.2.6 兔特异基因表达的 RT-PCR 检测... 27
1.2.7 统计分析...... 27
2 结果 ... 27
2.1 家兔卵巢卵泡不同发育时期的组织切片分析...... 27
2.2 30 日龄家兔卵巢体外培养.................. 29
2.3 新生兔卵巢体外培养.......... 32
2.4 RT-PCR 检测兔特异基因的表达....... 34
3 讨论 ... 34
3.1 家兔卵母细胞体内发育分析................. 34
3.2 卵母细胞体外发育的影响因素.............. 35
3.3 特异基因表达的影响因素.. 36
结论....... 38
参考文献.................. 39
致谢....... 43
个人简历...