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硕士论文-抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备和竞争ELISA方法的建立，共53页，33104字
摘 要
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）是猪 Glasser’s 病的病原菌，临床上以
纤维蛋白性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。Hps 是属于巴斯德菌科嗜血杆菌属
的一种不运动、NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。近年来，随着我国规模化养猪场
的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加
的重要原因之一，并给养猪业造成重大经济损失。本文研制了抗副猪嗜血杆菌的单克隆
抗体，并根据单抗建立了间接竞争 ELISA 的检测方法，对副猪嗜血杆菌的诊断和防制
具有重要意义。
本文分为两部分。第一部分是抗副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备及其生物学特性
鉴定，第二部分是应用单抗建立间接竞争 ELISA 的试验方法并对其反应条件进行优化。
以纯化的 SW124 全菌体免疫 Balb/c 小鼠，取脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合，将
提纯的外膜蛋白作为筛选抗原包被酶标板，经间接 ELISA 筛选，有限稀释法 3 次克隆，
获得了 3 株稳定分泌 Hps 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 2C6、4F10 和 5B9。
3 株单抗经亚类鉴定试剂盒测定，所产生抗体均为 IgG2b 型，腹水 ELISA 效价分别为
1:3200，1:12800 和 1:5120。通过 Western-blot 证明 2C6、4F10 和 5B9 这三株单克隆抗
体均是针对 37kDa 外膜蛋白的单抗，这些单抗的获得为 Hps 的研究及快速诊断方法的
建立奠定了基础。
选择一株针对外膜蛋白且腹水效价较高的单抗（4F10）来建立快速检测 Hps 抗体
的间接竞争 ELISA 方法。腹水单抗经 PEG 沉淀法纯化后，蛋白含量为 4.16mg/mL。以
SW124 外膜蛋白为包被抗原，利用针对 SW124 外膜蛋白的单克隆抗体与 Hps 猪血清竞
争该抗原，建立间接竞争 ELISA 方法检测 Hps 抗体，优化的反应条件为：将 SW124 外
膜蛋白作 500 倍稀释后包被酶标板，单克隆抗体作 1:600 稀释，竞争反应时间为 1h，酶
标抗体的工作浓度为 1:5000 且作用时间也为 1h，底物作用时间为 10min，建立的间接
竞争 ELISA 的方法检测 Hps 抗体样品具有较高特异性、稳定性和重复性。与正向间接
血凝试剂盒的检测结果相比，符合率达到 89.3%，从而为 Hps 抗体检测提供了一种有用
的实验室诊断方法。
关键词：Hps；单克隆抗体；生物学特性；间接竞争 ELISA
目 录
摘 要. I
ABSTRACT.......... II
英文缩写词表..... III
前言 1
文献综述........... 2
1 病原学 ....... 2
2 临床表现及病理变化 ........ 8
3 感染动物模型 . 9
4 诊断 ........ 10
5 协同感染 .... 11
6 防制 ........ 12
7 小结........ 15
试验一 副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备与生物学特性的研究 .... 16
1 材料与方法.. 16
2 结果与分析.. 20
3 讨论........ 24
试验二 单抗竞争 ELISA 检测 Hps 抗体方法的建立. 26
1 材料与方法 .. 26
2 结果与分析.. 28
3 讨论 ........ 35
全文总结.......... 38
参考文献.......... 39
致谢........... 44