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硕士论文-犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及抗原捕获 ELISA 方法的建立，共67页，35211字
摘 要
本研究以纯化的犬瘟热病毒(CDV)F 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，运用淋巴细胞杂交瘤
技术进行细胞融合，并用间接 ELISA 方法进行筛选，用 IFA、Western-blot 对各株抗 CDV
F 蛋白单克隆抗体进行生物学特性鉴定。结果获得 7 株单克隆抗体具有对 CDV 的特异
性，分别命名为：2D6，3E10，3A2，5B7，5F6，6H8，9B6；单抗亚类鉴定结果分别为
IgG2a，IgG1，IgG2b，IgG1，IgG1，IgG2a 和 IgG1；各株腹水单克隆抗体的 ELISA 效
价为 1:2000~1:16000；经细胞中和试验初步证实 2 株单抗(5B7、9B6)具有中和犬瘟热病
毒感染 Vero 细胞的作用，中和效价分别为 1:320 和 1:640；各株单抗亲和力测定结果为：
2D6>6H8>3E10>5F6>3A2>9B6>5B7；液相相加试验证实 7 株单抗的作用位点不同，其
中 2D6，5F6 的作用位点非常相近。
本研究采用饱和硫酸铵盐析和 Sephadex G-200 柱层析法从细胞培养物中纯化 CDV，
经紫外分光光度计测定，其浓度为 1.292mg/mL。并以此为抗原免疫兔子，制备高免血
清并提纯 IgG。兔抗 CDV 高免血清琼扩效价为 1:32 时收集血清，经饱和硫酸铵盐析和
Sephadex G-50 纯化，兔抗 CDV IgG 蛋白浓度为 8.246mg/mL。
选取 2D6 和制备的 CDV IgG 建立了检测 CDV 的抗原捕获 ELISA 方法并对其反应
条件进行优化。兔抗 CDV IgG、McAb、HRP-羊抗鼠最佳稀释度分别为 1:3200、1:200、
1:800 倍稀释。封闭液、抗体稀释液分别为 1%BSA、0.1%BSA；该检测方法特异、可靠、
方便、快捷，不需要特殊设备和技术，便于推广。
关键词：犬瘟热病毒；多克隆抗体；单克隆抗体；抗原捕获 ELISA
目录
摘 要 .............. I
英文摘要 ........II
英文缩写词表 .............. III
前 言 .............. 1
第一部分 文献综述
1 犬瘟热概述........... 2
2 诊断技术研究进展.............. 7
第二部分 研究内容
1.材料...... 13
1.1 病毒、细胞、血清及实验动物.... 13
1.2 主要仪器与耗材............. 13
1.3 主要试剂.......... 13
1.4 主要试剂的配制............. 14
2 方法..... 15
2.1CDV 抗原的制备 ............ 15
2.2 兔抗 CDV 多克隆抗体的制备 ..... 16
2.3 单克隆抗体的制备......... 17
2.4 McAbs 特性鉴定 ........... 19
2.5 抗原捕获 ELISA 方法的建立...... 21
2.6 抗原捕获 ELISA 试验方法的鉴定............ 24
3 结果..... 24
3.1CDV 的增殖 ..... 24
3.2CDV TCID50 的测定....... 25
3.3CDV 浓度测定结果 ........ 25
3.4 兔抗 CDV IgG 纯度鉴定及蛋白含量测定. 26
3.5 间接 ELISA 方法包被抗原与血清工作浓度的筛选 26
3.6 杂交瘤细胞株的建立..... 27
3.7 McAbs 特性鉴定 ........... 28
3.8 抗原捕获 ELISA 方法的建立..... 33
3.9 抗原捕获 ELISA 方法的鉴定..... 40
4.讨论...... 43
4.1 免疫抗原.......... 43
4.2 细胞融合及腹水单抗效价的测定 43
4.3 单抗的纯化...... 44
4.4 单抗亲和力...... 44
4.5 抗原表位初步分析......... 44
4.6 间接免疫荧光.. 45
4.7 McAb 的临床应用分析 . 45
4.8 建立抗原捕获 ELISA 诊断犬瘟热病毒方法的意义 46
4.9 抗原捕获 ELISA 诊断方法的建立............. 47
4.10 ELISA 的操作.............. 48
5 结论..... 49
参考文献. 50
致谢......... 50