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硕士论文-犬瘟热病毒f和h基因的克隆及在毕赤酵母中的表达
摘 要
犬瘟热(Canine distemper, CD)病的病原是犬瘟热病毒（Canine distemper virus
CDV），该病以双相热、急性鼻卡他、结膜炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。发
病率和死亡率较高，给养犬业和毛皮动物饲养业带来极大的危害，加强本病的预防免
疫极为重要，因此采用重组 DNA 技术生产基因工程亚单位疫苗无疑有重要意义。本
文成功实现了犬瘟热病毒 f、h 基因在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达，为
构建新型基因工程亚单位疫苗奠定基础。
本研究根据 GenBank 中已发表犬瘟热病毒 Onderstepoort 株设计引物，以犬瘟热
病毒 Lederle 株感染 Vero 细胞收获病毒悬液为模板，经 RT-PCR 扩增出 f 基因约 2.0kb
和 h 基因约 1.8kb 两个片段，按常规方法克隆到 pGEM-T Easy 载体，经蓝白斑筛选和
酶切分析获得阳性重组质粒，并进一步对两片段进行序列分析。结果表明：f 基因的开
放阅读框架(ORF)为 1989bp，h 开放阅读框架(ORF)为 1824bp。序列测定分析表明该株
f 基因与疫苗株 Onderstepoort、CDV3 核苷酸同源性分别为分别为：95.8%、98.9%，编
码氨基酸同源性分别为：92.5%、97.3%；与美国分离株 A75-17 核苷酸同源性为 91.5%，
编码氨基酸同源性为 88.4%；与中国分离株 BS0610、GN、HL、SC01、NM、ZD01
核苷酸同源性分别为分别为：90.1%、90.3%、91.4%、90.3%、90.8%、89.8%，核苷酸
同源性分别为分别为：87%、87.3%、89.2%、87.5%、87.3%、86.4%；该株 h 基因与
疫苗株 Onderstepoort、Convac、CDV3 核苷酸同源性分别为：96.4%、97.1%、99.6%，
编码氨基酸同源性分别为：94.9%、95.9%、98.9%；与中国分离株 JL(08)2、Liud、SD(08)1
核苷酸同源性分别为分别为：91.2%、92%、91.3%，编码氨基酸同源性分别为：91.6%、
91.6%、91.8%；与美国分离株 A92-6、A92-27/4、98-2646、01-2689、A75-17 核苷酸
同源性分别为：92.3%、91.9%、98.1%、90.7%、92.5%，编码氨基酸同源性分别为：
92.4%、92.1%、97%、90.1%、93.1%；与日本分离株 Ueno、Yanaka 核苷酸同源性分
别为：91.6%、91.5%，编码氨基酸同源性分别为：92%、91.8%。
以 pGEM-T-CDV-F 和 pGEM-T-CDV-H 为模板，分别设计了一对扩增 CDV 的 f 基
因和 h 基因主要抗原区特异性引物，在引物的上下游分别带有 EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位
点。通过 PCR 扩增获得目的片段后回收，用相同的限制性内切酶酶切表达载体
pPICZαA 后构建重组表达载体 pPICZαA-CDV-F 和 pPICZαA-CDV-H，并转入 E.coli
DH5α 中，得到基因工程菌，经酶切和测序鉴定证明克隆到载体 pPICZαA 上的外源基
因即为犬瘟热病毒的 f 和 h 基因。通过电击将经 SacⅠ酶切后线性化的 pPICZαA-CDV-F
和 pPICZαA-CDV-H 质粒转化到巴斯德毕赤酵母 X-33 中，经筛选、PCR 鉴定，获得含
有犬瘟热病毒 f 和 h 蛋白基因的重组酵母菌株，用 0.5%甲醇诱导目的蛋白表达。进行
表达产物的 SDS-PAGE 鉴定，可产生相对分子量约为 39KDa 和 18KDa 的表达产物，
表明成功地建立了含 CDV 的 F、H 蛋白的重组酵母表达系统。表达产物的 Western-blot
鉴定证明了表达的 F 和 H 蛋白具有反应原性。
关键词：犬瘟热病毒；f 和 h 基因；序列分析；巴斯德毕赤酵母；分泌表达
目录
摘 要………………………1
Abstract…………………3
英文缩写词………………5
文献综述…………………7
1 犬瘟热的研究概况……7
2 CDV 的生物学性状………7
3 CDV 的感染与免疫……13
4 CD 疫苗的研制…………14
5 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展………17
试验一犬瘟热病毒 f、h 基因全基因克隆与序列分析………………………22
1 材料…………………22
2 方法……………………22
3 结果与分析……………28
4 讨论……………………55
试验二犬瘟热病毒 f、h 基因片段的酵母表达载体的构建与鉴定…………57
1 材料……………………57
2 方法……………………58
3 结果与分析……………65
4 讨论……………………68
全文总结…………………71
参考文献…………………72
附录………………………79
致谢………………………82