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硕士论文-猪圆环病毒Ⅱ型全基因组的克隆与序列分析及ORF1基因的原核表达，共77页，33838字
摘 要
猪圆环病毒Ⅱ型（porcine circovirus 2,PCV2）是断乳仔猪多系统衰竭综合症
（post-weaning multi-systemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原。它不但可以
引起断奶仔猪衰竭、死亡，还与仔猪 A2 型先天性震颤（congential tremor type A
摘要
II,CT）、怀孕母猪流产(reproductive
failure)
、成年猪皮炎肾炎综合征（porcine
dermatitis and nephropathy,PDNS）和呼吸道疾病综合征（porcine respiratory disease
syndrome,PRDS）有关。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业，给世界上养猪国
家和地区带来巨大损失，更为严重的是 PCV2 还可引起免疫抑制，导致其它病原
的混合感染，造成的间接损失难以估计。
本论文的试验由两部分组成，一是从疑似病料里一次性克隆得到 PCV2 的全基
因组序列，二是亚克隆 PCV2 的 ORF1 基因，并在 pET-28a(+)中进行了原核表达。
1.参照国外发表的猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）全基因组序列,设计一对特异性引
物，利用该室保存的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）病料为模板，从中
提取 PCV2 基因组 DNA，并以之为模板进行 PCR（polymerase chain reaction）扩增。
将扩增得到的全基因片断克隆到 pMD18-T 载体上，经蓝白斑筛选和重组质粒 PCR
鉴定出阳性克隆并进行序列测定与分析，阳性质粒命名为 PCV2 all。用 DNAstar
工具将其与 GenBank 上国内外毒株进行了序列比较。结果表明扩增出了 1767bp 的
片段，序列分析表明与国内外毒株核苷酸同源性为高达 99.6%。
2.PCV2 的 ORF1 基因是 PCV2 基因组中最大的一个阅读框，编码病毒复制相
关蛋白，也称为 Rep 基因。设计一对特异性引物，以克隆得到的 PCV2 all 为模板，
利用 PCR 技术，扩增出了 945bp 大小的 ORF1 基因片断，亚克隆到 pMD18-T 载体
上，分别对阳性质粒和表达载体进行 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切，将 ORF1 片断以正
确读码框插入 pET-28a(+)中，构建了重组质粒 pET-ORF1。经 IPTG 诱导，成功表
达了 ORF1 基因编码的蛋白。表达的蛋白为融合蛋白，分子量大约为 41KD。经
Western-blot 检测，重组蛋白可被阳性血清识别。
关键词：猪圆环病毒Ⅱ型；全基因组；序列分析；ORF1 基因；原核表达
目 录
摘 要................I
Abstract ............I
缩略词表....... IV
前 言............... 1
文献综述......... 2
1 病原学. 2
2 病毒的分子生物学研究进展. 4
3 圆环病毒致病机理............... 11
4 猪圆环病毒流行病学........... 12
5 圆环病毒病流行原因........... 14
6 圆环病毒诊断方法............... 15
7 防制... 17
8 研究目的及意义. 17
试验内容....... 19
试验一 猪圆环病毒Ⅱ型全基因组的克隆与序列分析..... 19
1 材料与方法......... 19
2 结果... 25
3 讨论... 29
试验二
猪圆环病毒Ⅱ型 ORF1 基因的克隆与原核表达 ................ 31
1 材料与方法......... 31
2 结果... 37
3 讨论... 42
全文总结....... 44
参考文献....... 45
附录........... 50
致谢........... 67