学海网

硕士论文-猪圆环病毒2型的分子流行病学调查及ORF2基因的原核表达，共86页，35725字
摘要
猪圆环病毒 2 型(Porcine circovurus type 2, PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征
（postweaning multisystemic wasting syndrome）等相关疾病的重要病原。本研究利用 PCR 技
术对全国 9 个省规模化猪场发病猪群进行了 PCV2 检测，并完成了 41 株 PCV2 毒株的
全基因组序列测定与分析。PCV2 的 ORF2 基因不仅是其主要结构蛋白的编码基因，而
且也是区分 PCV1 和 PCV2 的重要区域，其编码蛋白具有良好的抗原性。利用 PCR 技术
扩增出 PCV2 FJ 株 ORF2 基因，并进行了诱导表达，成功实现了 ORF2 基因在大肠杆菌
中的表达。
采用 PCR 技术，对 PCV2 阳性病料进行全基因的扩增、克隆和测序，得到 1768bp
或 1767bp 的目的基因片段。应用 DNAstar 序列分析软件对所测定的 41 株 PCV2 序列进
行同源性分析。结果显示，我国 PCV2 流行毒株之间有很高的同源性(93.7%－100%)。
从系统发育进化树可以看出，我国 PCV2 流行毒株与美洲、欧洲和亚洲等国家的 PCV2
代表株也有很近的亲缘关系。PCV2 流行毒株的亲缘关系与地域之间没有十分密切的联
系。应用计算机分析两个主要阅读框 ORF1 和 ORF2 并推导其氨基酸序列，其中 ORF1
的核苷酸及氨基酸之间的同源性分别为 96.4%～100%和 96.5%～99.7%，说明 ORF1 非
常保守，这与其编码蛋白的功能有关。ORF2 之间的核苷酸及氨基酸同源性分别为
86.3%～99.6%和 88.2%～100%，变异相对于 ORF1 较大，与国外已发表毒株的 ORF2
比较，发现变异主要发生在三个区域，其中两个与病毒的抗原表位相对应，推测这些变
异可能与 PCV2 抗原性及致病性的改变有关。
采用 PCR 方法从已构建好的 PCV2 全基因重组质粒(pMD18-T-PCV2)中扩增出大小
为 579bp 的 ORF2 基因，亚克隆到表达载体 pET-32a 中，经 IPTG 诱导，成功表达了 ORF2
基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白，分子量 40Ku。经 Western-blot 检测，
重组蛋白可被 PCV2 阳性血清识别。
关键词：猪圆环病毒 2 型；全基因克隆；序列分析；ORF2 基因；原核表达
目录
摘要…………
英文摘要…...
缩略词表…...
前言…………
文献综述…...
1 病原学……
2 病毒的分子生物学研究进展……………..
3.圆环病毒病致病机理……
4 猪圆环病毒流行病学研究进展………….
5.圆环病毒病诊断方法……
6 防制……….
7 研究的目的及意义……….
试验内容
猪圆环病毒 2 型的分子流行病学调查
1.1 材料与方法
1.1.1 材料…….
1.1.2 方法……
1.2 结果………
1.2.1 检测引物 P1/P2 扩增结果.
1.2.2 PCV2 全基因的 PCR 扩增.
1.2.3 PCV2 全基因重组质粒鉴定………………...
1.2.4 核苷酸序列的测定结果 ..
1.2.5 序列分析
1.3 讨论……...
1.3.1 诊断引物的特异性………
1.3.2 发病的复杂性……………
1.3.3 发病的广泛性…………..
1.3.4 核苷酸序列比较…………
1.3.5 ORF1 推导的氨基酸序列的比较…………..
1.3.6 ORF2 推导的氨基酸序列的比较…………...
附图 ………..
2 猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因的克隆和原核表达……..
2.1 材料与方法………………
2.1.1 材料……
2.1.2 方法……
2.2 结果……..
2.2.1 PCV2 ORF2 基因的扩增…
2.2.2 重组表达质粒 pET-ORF2 的鉴定………….
2.2.3 基因工程重组菌的诱导表达和 SDS-PAGE 电泳……………
2.2.4 重组蛋白的 Western-blot 分析 ……………
2.3 讨论……
全文总结…...
参考文献…...
致谢…………