学海网

硕士论文-梨矮化性状的DNA分子标记及品种遗传多样性研究，共65页，32486字
摘要
本研究以‘矮化梨’(Pyrus communis Linn.)与‘茌梨’(Pyrus bretschneideri Rehd.)的杂交
后代群体（共 111 个单株）为试材，采用分离群体分组分析法（Bulked Segregate Analysis,
BSA），对来自西洋梨的矮化突变基因（pcDw）进行了 DNA 分子标记研究。另外，利
用随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术，探讨了 21 个栽培品种间的亲缘关系，同时，对 8
个沙梨主栽品种进行了 DNA 指纹鉴定。
获得如下研究结果：
1. 通过对 412 条随机引物的 BSA 筛选，获得了两个与梨矮化性状基因（pcDw）相连锁
的 RAPD 标记：S1172-940、S1212-318。它们与 pcDw 基因间的连锁距离分别为 8.2cM
和
7.2cM。这两个 RAPD标记均被转换成了 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)
标记，即 SCAR-940 和 SCAR-318。这一研究结果，为与矮化性状相连锁标记的遗传图谱
构建提供了依据。
2. 通过对 44 对来自梨或苹果的 SSR 引物的筛选，获得了一个与 pcDw 基因相连锁的 SSR
标记 KA14。该标记与 pcDw 基因的连锁距离为 14.8cM。
3. 从 40 个随机引物中筛选出了 33 个多态性好的引物，在 21 个栽培品种间进行了 RAPD
分析，最终得到 339 个清晰稳定的扩增位点，其中多态性位点为 292 个，占 86.1﹪。利
用 UPGMA (非加权配对算术平均)法进行了品种间相似系数的计算以及聚类分析，揭示
了这些品种间遗传上的差异程度。将 21 个品种在阈值 0.6400-0.6560 处分为六类。
4. 用 RAPD 标记技术对 8 个沙梨（Pyrus pyrifolia Nakai）主栽品种的 DNA 指纹进行了
分析，从 33 个 10 碱基随机引物中筛选出了两个多态性高的引物 S2075 和 S1296，它们
的扩增位点分别为 11 个和 10 个。根据这两个引物中任何一个的扩增图谱均可以将八个
品种区分开来。
关键词：梨；pcDw gene；RAPD；SCAR；亲缘关系；品种鉴定
目 录
中文摘要 ... 1
英文摘要 ... 2
引言....... 1
文献综述 ... 2
1.遗传标记的发展...... 2
2. 分子标记在果树种质资源研究中的应用 2
2.1 品种鉴定 .............. 3
2.2 杂种鉴定与突变体检测 ....... 4
2.3 遗传多样性分析.. 4
2.4 构建分子遗传图谱及农艺性状基因定位............... 4
2.5 果树分子标记辅助选择育种 7
2.6 果树质量性状连锁标记研究 8
2.6.1. 矮化性状的分子标记 ....... 8
2.6.2 抗病基因的标记 .............. 10
2.6.3 雌/雄性性状的标记 ......... 10
2.6.4 果实性状的标记 .............. 10
研究内容 . 12
1 梨矮化性状 DNA 标记 ......... 12
1.1 试验材料 ........... 12
1.2 试验方法 ........... 12
1.2.1 基因组 DNA 提取 ........... 12
1.2.2 近等基因池构建 .............. 12
1.2.3 RAPD 扩增及产物鉴定.... 13
1.2.4 梨矮化性状 RAPD 标记的筛选 ........ 13
1.2.5 RAPD 标记向 SCAR 标记的转换 ..... 13
1.2.5.1 RAPD 标记片段的回收克隆与测序................ 13
1.2.5.2 琼脂糖凝胶上 RAPD 标记片段的回收 .......... 13
1.2.5.3 重组质粒的构建 ........... 14
1.2.5.4 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞的制备............... 14
1.2.5.5 重组质粒转化感受态细胞............. 14
1.2.5.6 提取质粒 DNA ............. 15
1.2.5.7 重组质粒的酶切鉴定 ... 15
1.2.5.8 目的片段的测序 ........... 15
1.2.6 与梨矮化性状相连锁的 SSR 标记 ... 16
1.2.6.1 SSR 引物反应条件的优化.............. 16
1.2.6.2 SSR 多态性引物的筛选 16
1.2.6.3 SSR 多态性片段在杂交后代群体上的共分离分析 ......... 16
1.3 结果与分析 ....... 16
1.3.1 梨基因组 DNA 的提取.... 16
1.3.2 随机引物在基因池间的 RAPD 扩增筛选 ......... 17
1.3.3 多态性随机引物在杂交后代群体中验证.......... 18
1.3.4 梨矮化性状 RAPD 标记向 SCAR 标记转换..... 19
1.3.4.1 质粒 DNA 的酶切检测 . 22
1.3.4.2 标记片段的序列测定（对得到的目标片断进行分析） . 23
1.3.4.3 SCAR 引物设计............. 24
1.3.4.4 SCAR-PCR 扩增体系优化 ............. 24
1.3.4.5 SCAR 标记在群体分析 . 26
1.3.5 梨矮化性状的 SSR 标记 ................ 28
1.3.5.1 SSR 引物在基因池间的筛选 ....... 28
1.3.5.2 多态性引物在群体上的分析 .......... 29
1.4 讨论... 30
2 梨遗传多样性研究................ 32
2.1 材料与方法 ....... 32
2.1.1 材料 ................ 32
2.1.2 基因组 DNA 提取与检测 32
2.1.3 RAPD 扩增及引物筛选.... 32
2.1.4 数据统计与分析 .............. 33
2.2 结果与分析 ....... 33
2.2.1 品种间亲缘关系分析 ...... 33
2.2.1.1 引物筛选及 RAPD 扩增位点分析. 33
2.2.1.2 品种间的遗传相似性及聚类分析 .. 33
2.2.2 沙梨品种的 RAPD 指纹鉴定 ........... 36
2.3 讨 论 . 37
参考文献 . 39
英文缩写词表 .......... 44
附录......... 45
致谢......... 53
攻读硕士论文期间发表的学术论文 .......... 54