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硕士论文-地鳖虫多肽的分离及抗氧化活性研究，共57页，28697字
摘 要
地鳖虫（Eupoliphaga Sinensis Walker）是一种传统的中药材，具有散血淤、解凝活
血、接骨续筋等功效。现代医学研究及临床试验证明地鳖虫具有抑制肿瘤、调节血脂、
抗衰老等功效，其药食两用的特性使得地鳖虫的研究越来越受到人们的关注。地鳖虫蛋
白质含量很高，以干重计，地鳖虫蛋白质含量高达 60%以上，是典型的高蛋白食品。目
前对地鳖虫的研究主要集中在其初级加工工艺及药理作用方面，对其蛋白质以及抗氧化
活性方面的研究却鲜有报道。本文以地鳖虫为原料，利用从韩国引进的 Arazyme 高效蛋
白酶对地鳖虫酶解工艺进行优化，通过体外实验评价酶解液对羟自由基、超氧阴离子自
由基、DPPH 自由基及亚油酸自氧化反应的抑制效果；利用阳离子交换层析技术、阴离
子交换层析技术、制备型高效液相色谱技术分离酶解液中的抗氧化肽，并测定各组分的
抗氧化活性。主要研究内容及成果如下：
1. 本研究利用从韩国引进的高效Arazyme蛋白酶酶解地鳖虫，在单因素试验的基础
上，采用响应面分析法对酶解工艺进行优化，得到的最佳工艺参数为：每克地鳖虫的加
酶量为308.6U；酶解时间5.3h；水料比21.6:1，在此条件下得到地鳖虫酶解液中肽键含量
为10.423mmol/g?pro，与理论值10.462mmol/g?pro较为接近。这说明响应面法对地鳖虫酶解
条件的优化具有实际应用价值。
2.将地鳖虫酶解液进行冷冻干燥后，配成不同浓度的样品液，使得其在?OH、O2-?、
DPPH 反应体系中的终浓度分别为 10~50mg/mL、0.5~2.5mg/mL、16~80μg/mL；另取地
鳖虫酶解液冻干粉用 50mmol/L 的 PBS（pH=7.0）配成肽含量分别为 1.1mg、1.3mg、2.0mg
的样品液。结果表明：地鳖虫酶解物对?OH、O2-?、DPPH 三种自由基的最高清除率分别
为 75.15%、31.72%、74.88%，对亚油酸自氧化反应的抑制率最高为 95%。由于亚油酸
体系是目前国内外分离抗氧化肽时普遍采用的指标，因此在后续分离过程中采用样品对
亚油酸自氧化反应的抑制作用作为分离依据。
3．采用阳离子交换层析技术、阴离子交换层析技术以及高效液相色谱对地鳖虫酶
解液中的抗氧化肽进行分离纯化，同时测定各个组分对亚油酸自氧化反应的抑制作用。
在起始缓冲液为 0.02mol/L pH=4.0 的醋酸缓冲液，上样量为 50mg，NaCl 洗脱浓度为
0.25mol/L 的条件下，得到阳离子交换层析的四个组分 FⅠ，FⅡ，FⅢ，FⅣ，其对亚油
酸自氧化反应的抑制率分别为 73.69%，79.25%，43.65%，0%。在起始缓冲液为 0.02mol/L
pH=8.0 的 Tris-HCl 缓冲液，上样量为 50mg，NaCl 洗脱浓度为 0.25mol/L 的条件下，对
FⅡ进行阴离子交换层析得到两个组分，FⅡ-Ⅰ，FⅡ-Ⅱ，其对亚油酸自氧化反应的抑
制率分别为 73.3%和 81.83%。利用制备型高效液相色谱技术对 FⅡ-Ⅱ继续分离，结果
表明，在保留时间 13min 处可以得到一个单一峰 FⅡ-Ⅱ-Ⅰ。
关键词：地鳖虫；酶解；活性；抗氧化肽；分离
目 录
摘 要1
Abstract………3
第一章 前 言…5
1.1 药用昆虫的研究进展……5
1.2 地鳖虫的研究现状……7
1.3 抗氧化肽的研究进展…8
1.3.1 生物活性肽的概念及种类…………8
1.3.2 天然抗氧化肽的研究…9
1.3.3 水解蛋白类抗氧化肽的研究……10
1.4 本研究的目的和意义及技术路线…13
1.4.1 本研究的目的和意义13
1.4.2 研究内容13
1.4.3 技术路线15
第二章 地鳖虫酶解工艺的优化研究…16
2.1 材料与方法16
2.1.1 材料……16
2.1.2 试剂与仪器…………17
2.1.3 被水解的肽键含量测定…………17
2.1.4 蛋白质含量的测定…17
2.1.5 地鳖虫酶解工艺流程17
2.1.6 Arazyme 蛋白酶与木瓜蛋白酶对地鳖虫酶解效果的比较18
2.1.7 Arazyme 酶解地鳖虫制备抗氧化肽工艺的优化…………18
2.2 结果与讨论19
2.2.1 L-Leu 标准曲线的绘制…………19
2.2.2 Arazyme 蛋白酶与木瓜蛋白酶酶解效果的比较…………20
2.2.3 单因素试验…………20
2.2.4 响应面法对 Arazyme 酶解地鳖虫制备抗氧化肽工艺的优化…………22
2.2.5 回归模型的验证……25
2.3 本章小结…25
第三章 地鳖虫酶解液体外抗氧化作用的研究……26
3.1 材料与方法26
3.1.1 材料……26
3.1.2 试剂与仪器…………26
3.1.3 实验方法27
3.2 结果与讨论28
3.2.1 牛血清蛋白标准曲线的绘制……28
3.2.2 地鳖虫酶解液对羟自由基（?OH）的清除作用29
3.2.3 地鳖虫酶解液对超氧阴离子自由基（O2-?）的清除作用…29
3.2.4 地鳖虫酶解液对 DPPH 自由基的清除作用…30
3.2.5 地鳖虫酶解液对亚油酸自氧化反应的抑制作用…………30
3.3 本章小结…31
第四章 地鳖虫酶解物中抗氧化肽的分离…………32
4.1 材料与方法32
4.1.1 材料……32
4.1.2 试剂与仪器…………32
4.1.3 实验方法33
4.2 结果与讨论33
4.2.1 阳离子交换层析对地鳖虫酶解物中抗氧化肽的分离……34
4.2.2 阴离子交换层析对地鳖虫酶解物中抗氧化肽的分离……38
4.2.3 高效液相色谱对地鳖虫酶解物中抗氧化肽的分离………40
4.3 本章小结…41
结论与展望……42
参考文献………43
攻读硕士期间发表的论文…46
致 谢…………47