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硕士论文-Insulin通过Akt信号通路调控小鼠卵泡发生的分子机制，共55页，32390字
摘 要
哺乳动物卵巢卵母细胞体外发育的研究，最初主要关注出生后卵泡的生长发育与卵
母细胞的成熟与受精，而原始卵泡体外形成与发育激活的研究鲜有报道，这使人们对原
始卵泡的形成和发育激活的调控机制了解甚少。对于卵泡形成与发育激活的研究来说，
真正的挑战是建立原始卵泡的体外形成与发育的技术体系，然后利用卵泡发育的体外模
型进行其机制研究。这对于开发卵母细胞资源，促进高产家畜的繁殖潜能挖掘，推迟女
性的更年期，治疗卵巢早衰等疾病都至关重要。本实验的目的是借助本实验室建立的原
始卵泡体外形成与发育激活的技术平台，探索 insulin 通过 PI3K/Akt 信号通路调控生殖
细胞 Cyst 解聚、原始卵泡形成和发育激活的分子机制。
本研究首先检测了小鼠体内原始卵泡形成和发育过程中Akt磷酸化水平的变化。收
集13.5 dpc、16.5 dpc、0 dpp、3 dpp胎鼠或新生鼠卵巢组织进行Akt和pAkt蛋白的Western
Blot检测，结果显示：从13.5 dpc到3 dpp的小鼠卵巢卵泡发育过程中，pAkt/Akt的比值有
显著的提高，特别是在3 dpp的小鼠卵巢细胞中pAkt/Akt的比值达到了1.689±0.098%，显
著高于16.5 dpc胎鼠卵巢卵泡的pAkt/Akt比值0.846±0.102%(P<0.01)。收集16.5 dpc胎鼠卵
巢组织体外培养 6 d，对培养的卵巢组织进行Western Blot检测，结果发现，Akt的磷酸
化水平与体内的变化趋势一致。在16.5 dpc胎鼠卵巢培养时，添加0、1、5和10 μg/ml
insulin，并且在培养的15、30、45和60 min四个时间点收集卵巢样品进行检测，发现5 μg/ml
insulin处理组的pAkt/Akt比值极显著高于没有添加insulin的对照组(P<0.01)，并且在15、
30、45和60 min各时间点都有相同趋势。免疫组化试验和定量PCR实验也证实了添加5
μg/ml insulin培养30 min后，InsR的表达量明显增加。另外，培养时添加PI3K的抑制剂
LY294002能显著降低5 μg/ml insulin处理的16.5 dpc卵巢pAkt/Akt比值。这说明insulin通
过InsR影响了PI3K/Akt信号通路。
将16.5 dpc卵巢体外培养到3 d时，添加5 μg/ml insulin的实验组和对照组在卵泡形成
与发育激活方面的差异不大，即实验组与对照组之间，卵母细胞在Cysts、原始卵泡和初
级卵泡中的比例差异不大。然而，当将16.5 dpc卵巢培养到5 d时，卵母细胞在Cysts中的
比例，实验组（63.4±8.91%）和对照组（53.13±10.17%）之间有极显著的差异(P<0.01)。
此外，实验组处于初级卵泡阶段的卵母细胞比率为1.76±1.07%，显著小于对照组处于初
级卵泡阶段的卵母细胞比率8.33±0.77% (P<0.05)。这些结果说明，insulin阻碍了卵泡的
形成与发育激活，而这个作用途径是通过Insulin-InsR-PI3K-Akt实现的，Akt磷酸化的增
强阻碍了卵泡的形成与发育激活。
将 3 dpp 小鼠卵巢体外培养 5 d，分别添加 5 μg/ml 和 10 μg/ml insulin 的试验组卵巢
pAkt/Akt 分别为 0.46±0.047%和 0.253±0.051%，与对照组的 0.63±0.029%差异显著或极
显著(P<0.05, P<0.01)。利用组化技术分析了体外培养的卵巢卵泡发育情况，结果显示：
3 dpp 卵巢添加 insulin 培养 5 d 后，卵泡形成与发育激活都得到了促进，卵母细胞在 Cysts
中的比率，添加 5 μg/ml insulin 的实验组为 10.28±2.97%，与对照组 23.11±10.78%差异
极显著 (P<0.01)。卵母细胞在次级卵泡中的比率，实验组为 7.23±0.94%，对照组为
2.31±0.47%，差异极显著(P<0.01)。并且，添加 insulin 使 3 dpp 新生鼠卵巢中 Pten 基因
5‘调控区的 DNA 甲基化水平升高，使 Pten 和 Foxo3a 基因的表达水平降低。这说明，
insulin 对 3 dpp 新生鼠卵巢卵泡体外发育的促进是通过了 Insulin-Pten-PI3K-Akt-Foxo3a
的调节途径。
综上所述，insulin 对卵泡形成与发育激活的调控是有阶段特异性的。也就是说，
insulin 对 16.5 dpc 胎鼠卵泡的体外形成与发育是抑制的，对出生后 3 d 的小鼠卵巢卵泡
的体外发育是促进的，并且这些作用皆是通过 Insulin-PI3K-Akt 信号通路进行调节的。
关键词：小鼠；卵泡发育；insulin；PI3K/Akt 信号通路
目录
摘 要...... 1
Abstract. 1
前 言...... 1
第一部分 文献综述 2
1 Insulin 与 PI3K/Akt 信号通路 ...... 2
1.1 Insulin 的作用机理.... 3
1.2 PI3K 的分型、结构与功能 3
1.3 Akt 的分型、结构与功能... 4
1.4 Foxo3a 的分型、结构与功能 ..... 5
1.5 Pten 的结构与功能 .... 5
2 卵泡形成与发育的调控机制 5
2.1 卵泡的发育过程........ 6
2.2 PI3K/Akt 信号通路对卵泡发育的调控 ....... 7
2.3 其他因子对卵泡发育的调控...... 8
3 PCOS 与 PI3K/Akt 信号通路........ 9
3.1 PCOS 患者的 IR........ 9
3.2 IR 与 PI3K/Akt 信号通路 10
4 哺乳动物卵泡体外发生的研究进展 .... 11
第二部分 试验研究....... 13
1 材料与方法........ 13
1.1 试验材料 13
1.1.1 试验动物...... 13
1.1.2 试验试剂...... 13
1.1.3 试验仪器...... 14
1.2 试验方法 15
1.2.1 卵巢的分离.. 15
1.2.2 卵巢的体外培养... 15
1.2.3 Western Blot 样品的收集....... 15
1.2.4 Western Blot 实验步骤.. 15
1.2.5 卵母细胞的收集... 16
1.2.6 组织切片的制作... 17
1.2.7 Cyst 以及各级卵泡计数  17
1.2.8 免疫组织化学....... 17
1.2.9 卵母细胞 DNA 的提取 . 19
1.2.10 亚硫酸盐序列测定...... 19
1.2.11 卵母细胞 RNA 的提取及 cDNA 的合成 ....... 22
1.2.12 定量 PCR... 22
1.2.13 统计方法.... 23
2 结果与分析........ 23
2.1 卵泡形成过程中 Akt 磷酸化水平的检测 . 23
2.2 Insulin 促进了 16.5dpc 胎鼠卵巢 Akt 的磷酸化 ........ 24
2.3 Insulin 抑制体 16.5dpc 胎鼠卵巢卵泡的体外发育..... 26
2.4 Insulin 抑制 3dpp 小鼠卵巢 Akt 磷酸化 ... 27
2.5 Insulin 促进了 3dpp 小鼠原始卵泡形成与发育  28
2.6 通过抑制 Pten 的表达，Insulin 促进体外培养的 3dpp 小鼠卵巢卵泡的发育.... 29
3 讨论.. 31
3.1 Insulin 影响卵泡形成的调控机制 ..... 31
3.2 Insulin 调控原始卵泡发育激活关键基因的表达 ........ 32
结
论....... 34
参考文献....... 35
致
谢....... 41
个人简介....... 42