冷冻卵子的进展
摘要：美国一家生殖公司于2010-5-6日宣布，该公司成功使冷冻卵子受精，婴儿已出生。自1986年世界首例冷冻卵子冻融复苏后行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)获得妊娠成功后,卵子冷冻在辅助生殖技术领域掀起热潮。卵子冷冻为女性的生育力保存开辟了新前景,但由于技术及条件的制约,卵子冷冻及其应用一直在摸索中发展。随着冻融技术、胞浆内单精子注射及未成熟卵体外培养技术的发展,卵子冷冻近年取得一定进展,已在临床应用,为女性生育力保存奠定了基础。这意味着今后女性生育将不受年龄限制，她们可以根据需要推迟生孩子的时间。
关键词：冷冻卵子 生育力保存 卵子冷冻复苏
胚胎冷冻现已成为辅助生殖技术中一项成熟的且不可缺少的技术,但是卵子冷冻自1986年澳大利亚Chen[1]首次报道用冷冻卵子进行体外受精(IVF)并成功妊娠后,二十多年来发展曲折。冻融技术及胞浆内单精子注射(ICSI)很大程度上为卵子冷冻解决了困难,大大提高了冷冻卵子的复苏率及受精率。实际上卵子冷冻比胚胎冷冻有更广泛的应用前景。
人卵冻存的意义在于:(1)为手术后将丧失卵巢功能的妇女在术前将卵子冷冻,为将来提供生育机会。(2)调配供卵与受孕之间的时间。如为推迟生育的妇女提前将卵子冷冻,以保证日后生育时卵子的受精能力;在受卵者的各种生理状况调至适于受孕时,随时可接受供卵者解冻后的卵子受精。(3)辅助生殖治疗过程中超排卵方案获得的卵子移植后将多余卵子冻存,供日后患者本人或他人使用。(4)建立卵子库,为患者提供更多选择配子的机会。
卵子冷冻的方法
一、慢速冷冻法
人类MⅡ期卵母细胞的形态及结构复杂,对低温特别敏感,加上质膜通透性与稳定性差,在冷冻储存过程中极易受损,且该期细胞特殊的体积与表面积之比使卵母细胞在冷冻过程中脱水困难等,在很大程度上制约了卵母细胞冷冻的普及和发展。目前较常用的方法是慢速程序化冷冻。慢速冷冻就是在缓慢降温的过程中让细胞充分脱水,在-6℃～-8℃时植冰即人工诱导结晶,目前世界上较一致认为-7℃为最佳植冰温度,再以0.3℃/min速度待温度降至-35℃～-70℃后投入液氮中。慢速冷冻较常使用的冷冻保护剂为丙二醇(PROH)和蔗糖。慢速冷冻法需要严格控制冷冻和解冻过程中形成的冰晶数量,期望在各因素间保持精细的平衡,减少冰晶造成的损伤、渗透压改变造成的损伤。有报道慢速冷冻-快速解冻可以获得86.1%的复苏率。说明慢速冷冻仍为卵子冷冻的有效方法之一。
二、玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻是近几年的新兴技术,细胞在冷冻过程中容易形成冰晶,损伤细胞膜及细胞内结构,对细胞造成致命的伤害。然而玻璃化冷冻就可以很好地解决这一问题。玻璃化冷冻技术的基本原理是高浓度(4～6mol/L)的冷冻保护剂溶液[如乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)等]经急速降温后,由液态转化为外形类似玻璃状的非晶体化固体状态。由于玻璃化液在低温时黏稠度变得很高而不结晶,形成形态不规则的玻璃样固体,并保留了细胞内外液体正常的分子和离子分布,避免产生冷冻损伤。目前使用的玻璃化冷冻保护剂有渗透性保护剂和非渗透性保护剂两种。渗透性保护剂通常是小分子物质,有PROH,EG,DMSO,乙酞胺和甲醇等;非渗透性保护剂一般是大分子物质,其不能渗透到细胞内,主要有蔗糖、PEG、葡聚糖、白蛋白以及轻乙基淀粉等。目前对于玻璃化冷冻保护剂的选择还没有达成共识。有实验表明,联合运用两种作用机制不同的细胞内渗透性保护剂进行玻璃化冷冻,可以加强冷冻效果和减轻毒性。玻璃化冷冻简单、方便、高效等优点不断被发现并采纳,然而至今仍缺少标准的玻璃化的冷冻方案,没有形成一种完善而实用的玻璃化冷冻液的组成,对保护剂的选择、载体的选择仍处于探索中[2],因此报道玻璃化冷冻的复苏率不稳定,是须共同努力解决的问题。
冻融卵子复苏后的受精
早期卵子冷冻复苏后受精率极为低下,这可能是卵子冷冻不能像胚胎冷冻被广泛应用的重要原因,但是自ICSI诞生后很好的解决了这一问题1995年,Gook等报道[3],ICSI技术可应用于冷冻卵子的受精过程,而且该技术可提高受精率和冷冻率1995年Kazem将促排卵过程中自愿捐献的220枚卵行慢速冷冻快速复苏后随机分为两组,分别行普通的IVF与ICSI受精,结果IVF组受精率及卵裂率明显低于ICSI组,说明ICSI可以提高冻融卵子的受精率。Porcu等首次采用ICSI技术,为1例有10年输卵管性不孕史的28岁女性进行冷冻卵子受精,该患者成功足月分娩一健康女婴。Porcu等[4]报道,首期卵子冷冻计划共有23例输卵管性不孕的妇女,其冰冻卵子存活率为59.5%(201/338例),采用IC技术的受精率为64.1%,卵裂率为90.8%,3例妇女成功受孕,其中1例分娩1健康女婴;第二期卵子冷冻计划共有96例患者,1 502个冻融卵子的存活率为54.1%,受精率为57.7%,卵裂率为91.2%,16例妇女成功妊娠,其中9例共分娩11例健康婴儿。同时,Porcu等还采用ICSI技术进行冷冻精子和冷冻卵子受精、冷冻卵子和附睾及睾丸精子受精,并且都成功妊娠,分娩健康婴儿。虽然ICSI辅助受精能够大大提高冻融卵子的受精率,但是并不能提高卵裂率及优质胚胎率,后两者决定于精子与卵子的质量[5]说明冻融后卵子的受精及其胚胎发育需进一步深入研究。
卵子冷冻能够被广泛应用于临床是当今生殖领域共同的目标。由于卵子冷冻有其独特优点,不仅可有效利用行IVF-ET患者多余的卵子,为因遗传免疫环境等原因引起的卵巢早衰患者提供生育源泉;还可以为患恶性肿瘤的年轻女性保留生育能力,此外还可以为那些想延迟生育女性提供优生优育保障。冷冻卵子也可以避免冷冻胚胎引起的法律及伦理问题。根据5月6号的新闻报导美国一家生殖公司宣布，该公司成功使冷冻卵子受精，婴儿已出生。说明
冷冻卵子技术已经较为成熟，将越来越多人能受益其中。
参考文献：
[1]Chen C.Pregnancyafter human oocyte cryopreservation[J].Lancet,1986,1(8486):884-886.
[2]Succu S,Leoni GG,Bebbere D,et al.Vitrification devices affectstructural and molecular status of in vitromatured ovine oocytes[J].Mol Reprod Dev,2007,74(10):1337-1344.
[3]Gook DA,Schiewe MC,Osborn SM,et al.Intracytoplasmic sperm injection and embryo development of human oocytes cryopreserved using1,2-propanediol[J] .HumReprod,
1995,10(10):2637-2641
[4]Porcu E,Fabbri R,Damiano G,et al.Clinical experience andappli-cations of oocyte cryopreservation[J].Mol Cell Endocrinol,2000,169(1-2):33-37.
[5]Yoeli R,OrvietoR,Ashkenazi J,et al.Comparison ofembryoquality between intracytoplasmic sperminjection and in vitrofertilization in siblingoocytes[J].J Assist Reprod Genet,2008,25(1):23-28.
