雷公藤甲素对体外培养的变应性接触性皮炎小鼠Th细胞Fas表达的影响
雷公藤甲素对体外培养的变应性接触性皮炎小鼠Th细胞Fas表达的影响
【摘要】 目的为了探讨雷公藤甲素对体外培养的变应性接触性皮炎（ACD）小鼠Th细胞Fas表达的影响。方法以二硝基氯苯（DNCB）制作小鼠ACD模型，分离ACD小鼠淋巴细胞，不同浓度雷公藤甲素体外作用48 h后，利用流式细胞仪检测Th细胞Fas表达率。结果雷公藤甲素3个浓度组体外培养的ACD小鼠淋巴细胞Fas表达均高于对照组（P＜0.01），高浓度组与中浓度和低浓度比较Fas表达水平显著升高（P＜0.01），中浓度与低浓度比较表达水平差异具有显著性（P＜0.05）。结论雷公藤甲素可以促进体外培养的ACD小鼠淋巴细胞Fas的表达，可能是治疗ACD的机理之一。
【关键词】 雷公藤甲素 接触性皮炎 T细胞
Abstract:ObjectiveTo study the effect of Triptolide on Fas Expression of T helper in Cultured T lymphocyte in mice with Allergic Contact Dermatitis (ACD). MethodsThe mouse model of ACD was established by sensitizing the skin of Kunming mice with dinitrochlorobenzen(DNCB). Lymphocyte was isolated from MICE spleen, and cultivated in vitro with 0.1, 1.0, 10 μmol/L concentration of Triptolide for 48 hours, then the Fas expression of T helper was detected by flow cytometry.ResultsThe expression of T helper in the three groups was higher than that in the control group, and those in the 10 and 1.0 μmol/L concentration groups were higher than that in the 0.1 μmol/L concentration group.ConclusionIt may be one of mechanism to treat ACD that Triptolide can down regulate the Fas expression of T helper in Cultured T lymphocyte in mouse model of ACD.
Key words:Triptolide; Allergic Contact Dermatitis; T helper cell
雷公藤制剂因其独特的抗炎、免疫调节作用被广泛应用于多种皮肤疾病的治疗，雷公藤甲素（Triptolide）又称雷公藤内酯醇、雷公藤内酯，是从卫矛科雷公藤属雷公藤、昆明山海棠等植物中分离出来的一种含有3个环氧基的二萜内酯化合物，是雷公藤制剂的主要有效成分之一。本项目拟通过以下实验探讨雷公藤甲素对体外培养的变应性接触性皮炎（ACD）小鼠T辅助细胞（Th）细胞Fas表达影响。
1 器材
1.1 动物
6～8周龄昆明鼠，雄性，体重18～22 g，由天津医科大学实验动物研究室提供。
1.2 仪器
超净工作台（苏净公司，苏州）；CO2培养箱（Thermo公司，德国）；倒置显微镜(OLYMPUS，日本)；流式细胞仪(FACSCallibur，BD公司，美国）；台式高速离心机(北京医用离心机厂)；24孔细胞培养板。
1.3 试剂
RPMI-1640培养液（Gibco公司）；胎牛血清（中国医学科学研究院血液病研究所）；青霉素、链霉素（晶美生物工程有限公司，深圳）；丙酮、2，4-二硝基氯苯（DNCB）（天津市化学试剂公司），PHA-P（Sigma，美国）；PE anti-mouse CD95（Fas/APO-1）荧光抗体；APC-Cy7 anti-mouse CD4荧光抗体。雷公藤甲素标准品购自福建医学科学研究所药物室。
2 方法
2.1 ACD小鼠模型制作实验当日剪除小鼠背部3 cm2毛，暴露皮肤，在去毛处皮肤外涂5% DNCB；10 d后，小鼠耳廓内外两侧外涂1% DNCB 30 μl；1周后重复激发1次，连续4次激发。最终1次24 h后观察耳壳皮损严重度并切取皮肤及右耳做组织病理检查。在HE切片下对炎性细胞（包括淋巴细胞，粒细胞）浸润，表皮细胞间水肿，细胞内水肿，网状变性，表皮内水疱，以及表皮坏死病理变化进行观察，确定变应性皮炎小鼠模型成功。
2.2 ACD小鼠淋巴细胞的分离培养小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇中浸泡3 min，无菌取脾脏，200目不锈钢网置于含Hanks液的平皿中（5 ml Hanks液），用注射器芯研磨脾，Hanks液冲洗过滤脾细胞，收集细胞悬液，1 500 r/min, 离心5 min，以RPMI-1640（含20%胎牛血清）10 ml悬浮细胞，计数，调整为2×106/ml浓度；培养板每培养孔加0.5 ml细胞，实验工作液分3个终浓度，雷公藤红素低、中、高浓度分别为0.1，1.0，10 μmol/L，每组设3个复孔。混匀后放入含有5% CO2的CO2温箱内，37℃，培养48h后进行实验检测。
2.3 Th细胞Fas表达检测吸取培养孔内细胞，移入10 ml离心管中，1 500 r/min, 离心5 min，吸弃上清液；用1 ml PBS重悬细胞，移入试管中；离心，弃上清液，洗涤细胞1次，吸弃上清液；每管分别加入1.25 μl PE anti-mouse CD95，5 μl APC-Cy7 anti-mouse CD4；振荡，室温避光保存30 min；加入500 μl 4%多聚甲醛，应用流式细胞仪进行检测，经488 nm激光激发，依CellQuest软件，每个样本获取10 000个细胞。
2.4 统计学方法
实验数据经SPSS11.0软件处理，多组间的两两比较采用单因素方差分析。
3 结果
雷公藤甲素对体外培养ACD小鼠淋巴细胞Fas表达的影响 （略）
雷公藤甲素3个浓度组体外培养的ACD小鼠淋巴细胞Fas表达与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），药物高浓度组与中浓度和低浓度比较Fas表达水平显著升高（P＜0.01），中浓度与低浓度比较表达水平差异具有显著性（P＜0.05）。雷公藤甲素可以促进体外培养的ACD小鼠淋巴细胞Fas的表达，并且表达水平随着药物浓度的增加而增强，Fas表达呈浓度依赖性。
4 讨论
雷公藤甲素作为雷公藤中的主要活性物质，具有免疫抑制作用，能抑制淋巴细胞和肿瘤细胞，并诱导其凋亡。
Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，大量研究结果表明Fas受体在凋亡事件中起传导信号的作用。CD4分子分布在Th表面，在T细胞亚群的鉴别中具有重要意义。CD4阳性T细胞具有重要的免疫功能，CD4分子可与抗原提呈细胞表面的MHC-Ⅱ类抗原非多态部分相结合，协助Th细胞识别APC细胞表面外来抗原与MHC-Ⅱ类抗原的复合物［1］。雷公藤甲素3个浓度对体外培养的ACD小鼠Th细胞表面Fas表达均有促进作用（P＜0.01），两两比较显示高浓度组均高于与中浓度和低浓度组Fas表达（P＜0.01），中浓度与低浓度比较表达水平差异具有显著性（P＜0.05）。雷公藤甲素可以促进体外培养的ACD小鼠Th细胞Fas的表达，并且表达水平随着药物浓度的增加而增强，Fas表达呈浓度依赖性。
ACD被认为是一种Ⅳ型变态反应，其发病过程主要涉及变应原与皮肤接触形成变应原载体复合物；诱导皮肤中抗原提呈细胞处理并提呈变应原给T淋巴细胞；T淋巴细胞活化形成抗原特异致敏的T淋巴细胞；再次接触相同变应原引发皮肤炎症反应。细胞凋亡在致敏的T淋巴细胞的清除起到重要的作用［2］，促进体外培养的ACD小鼠Th细胞Fas的表达，可能是雷公藤甲素治疗ACD的机理之一。
【参考文献】
［1］Roberts AI, Devadas S, Zhang X,et al. The role of activation-induced cell death in the differentiation of T-helper-cell subsets［J］. Immunol Res. 2003，28(3):285.
［2］Scholz M, Cinatl J. Fas/FasL interaction: a novel immune therapy approach with immobilized biologicals［J］. Med Res Rev，2005，25(3):331.
